【技术实现步骤摘要】
—种大肠杆菌-棒状杆菌穿梭型诱导表达载体pDXW-8及其构建方法，属于微生物 基因工程领域。
技术介绍
棒状杆菌是一类革兰氏阳性菌，属于具有中度到高GC含量的放线菌。自人们首次 分离谷氨酸棒状杆菌生产L-谷氨酸以来(Kinoshita等，1957年)，棒状杆菌的三个主要代 表谷氨酸棒状杆菌，黄色短杆菌，和乳糖发酵短杆菌，已经被广泛用于生产氨基酸。这里 特别指出，通过DNA-DNA杂交实验发现，这三个不同物种之间只有很小的差别(Liebl等， 1991)。 由于已累计了大量的关于谷氨酸棒状杆菌生理学，生物化学和遗传学知识 (Eggeling and Bott，2005 ;Burkovski， 2008)，代谢工程已经取代经典的随机突变，成为棒 状杆菌菌种改良的主要策略。 可应用于棒状杆菌的载体系统的构建，是生产菌株的代谢工程改良以及棒状杆 菌基础研究的基础。目前，已经有一些可以应用于棒状杆菌的表达载体(Eggeling and Bott，2005)。根据不同的棒状杆菌复制子，我们把这些表达载体分为四组。第一组包括 pEKExl和pXMJ19，其复制子来自质粒pBL...
【技术保护点】
一种大肠杆菌－棒状杆菌穿梭型诱导表达载体ｐＤＸＷ－８，其核苷酸序列为：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１。
【技术特征摘要】
一种大肠杆菌-棒状杆菌穿梭型诱导表达载体pDXW-8，其核苷酸序列为SEQ ID NO1。2. 根据权利要求1所述的表达载体pDXW-8，其特征在于含有用于严谨控制tac启动子表达的负调控基因laCIPF1°4JA 6985到5903位，其携带 的外源启动子PF104及SD序列，PF104及SD序列核苷酸序列为cagcgtattt gaccgatccggacacct匿ataatgtetg gattttgtcg g逛aaaggajtg gtgaat，其中划线部分为启动子PF104序列，加框部分为SD序列；含有用于克隆外源基因的人工合成的74bp多克隆位点MCS，从9546位到9472位， 包含如下11个单一的限制性内切酶切点EcoRI， Nhel， Sacl， Ncol， Notl， Xhol， Kpnl， BglII， Sacl I ， AflII，禾口 HindIII，其核苷酸序列为gaattcgctagcgagctccc atgggcggcc gcctcgaggg taccagatct ccgcggctta agctgcagaa gctt。3.如权利要求1或2所述的表达载体pDXW-8的构建方法，其特征是以质粒pET-28a为模板，kan-F和kan-R为引物，通过PCR扩增1023bp的卡那霉素抗 性基因，在扩增产物的5'和3'末端引入限制酶SgrAI酶切位点，PCR产物用SgrAI酶切； pKK223-3同样用SgrAI酶切，用碱性磷酸酶CIAP去磷酸化；两者连接，由此产生的质粒大 小为5617bp，命名为pDXW-5 ;以质粒pC2为模板，r印-F和r印-R为引物，通过PCR扩增2686bp的r印片段，在扩增 产物的5'和3'末端引入限制酶PshAI酶切位点，PCR产物用PshAI酶切，并连接到同样 用PshAI酶切，且用CIAP去磷酸化后的pDXW-5，由此产生的质粒大小为8313bp，命名为为 pDXW-6 ;为了证明r印片段和卡那基因片段在棒状杆菌中的功能，我们用质粒pDXW-6转化 黄色短杆菌B. f lavum，并选择卡那霉素抗性克隆；以质粒pET-28a为模板，携带PF104序列的正向引物Iacl-F，和反向引物Iacl-R为引 物，通过PCR扩增1191bp的lacf基因，在扩增产物的5'和3'末端引入限制酶EcoRI 和Hindi 11酶切位点，PCR产物用EcoRI和Hindi 11双切，并连接到同样用EcoRI和Hindi 11 双切后的pDXW-6，由此产生的质粒大小为9510bp，命名为为pDXW-7 ;人工合成的74bp多克隆位点MCS的DNA片段5' gaattcgcta gcgagctcccatgggcggcc gcctcgaggg taccagatct ccgcggctta agctgcagaa gctt 3，，它包含有11个单一的限制性 内切酶切点EcoRI，NheI，...
【专利技术属性】
技术研发人员：王小元，徐大庆，李烨，谭延振，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32[]
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