一种单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统，元件的连接顺序为5-’CMV-TetR-KRAB-SV40polyA-rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE-Tight-PminCMV-EcoR?Ⅰ-Spe?Ⅰ-SV40polyA-3’，Tight-PminCMV左侧的复合元件rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE的连接方式为3’-rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE-5’-5’-Tight-PminCMV-3’，其余元件均按与该系统相同方向5’-3’顺序连接；两个酶切位点EcoR?Ⅰ和Spe?Ⅰ位于元件Tight-PminCMV和元件SV40polyA之间。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生命科学领域，具体涉及到单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统及其构建方法和应用。
技术介绍
基因治疗是目前肿瘤治疗领域很有希望的治疗方法之一，而基因治疗中对所用治疗基因的准确快速的调控对提高疗效，减少治疗基因带来的负作用至关重要。Tet-on诱导表达系统，是四环素诱导系统的一种，特点是加入四环素或者其衍生物如强力霉素(Doxycycline, Dox)等诱导药物后,受控基因表达开启。Tet_on诱导表达系统是广泛应用的诱导表达系统，具有本底低，高诱导倍数，高特异性，诱导剂无明显毒性等优点，非常适合对治疗基因的调控。现阶段，该系统已被应用于诸多疾病的研究和治疗中。但现有的Tet-on 诱导表达系统依然存在较明显的本底渗漏和调控蛋白过量表达对细胞的干扰作用，同时以往Tet-o诱导表达系统的建立需要调控载体和反应载体两个质粒，如此降低了系统建立的效率。单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统可以克服两质粒系统的缺点，同时具有低本底渗漏，并易于用于如腺病毒等载体，因此对于肿瘤治疗至关重要。通过建立一种全部调控系统和目的基因都位于一个载体上，并具有低本底渗漏和高效诱导倍数的Tet-on诱导表达系统，实现对各种基因，如报告基因或者抗肿瘤基因TRAIL的有效调控表达；并能应用到如腺病毒载体等病毒载体上，使其获得的具有更好的活力，为肿瘤基因治疗提供有力的工具。
技术实现思路
本专利技术所要解决的一个技术问题在于提供一种单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统。本专利技术所要解决的另一个技术问题在于提供一种单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统的构建方法。本专利技术所要解决的还有一个技术问题在于为单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统提供一种新用途。解决上述技术问题采用的技术方案是单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统元件的连接顺序为 5_’ CMV-TetR-KRAB-SV40polyA-rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE- Tight-PminCMV-EcoR I -Spe I -SV40polyA_3’，Tight-PminCMV 左侧的复合兀件rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE 的连接方式为 3’ -rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE_5’ -5’ -Tight-PminCMV-3’，其余元件均按与该系统相同方向5’ -3’顺序连接；两个酶切位点EcoRI和Spe I位于元件Tight-PminCMV和元件SV40polyA之间，该系统序列如核苷酸序列表中 No. 11。本专利技术的TRE元件左侧的PminCMV元件的方向与右侧的Tight-PminCMV启动方向相反，均与TRE元件相邻。在本专利技术单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统的EcoR I与Spe I位点间连入的目的基因是报告基因或肿瘤治疗基因。单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统的构建方法包括下述步骤I、构建含有Kpn I -Cla I -Not I -Xho I -EcoR I -Spe I 限制性内切酶位点的腺病毒El区穿梭载体使用酶切连接法将DNA linker (Kpn I -Cla I -Not I -Xho I -EcoR I -SpeI -Spe I )连接入腺病毒El区穿梭载体，获得所需要的载体；2、扩增构建单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统所需的元件通过聚合酶链式反应扩增构建单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统所需的元 件，元件包括 CMV、TetR-KRAB, SV40polyA、Tight-PminCMV, rtTA2S_M2。3、构建带有复合元件TRE-KB-PminCMV-EB-rtTA2S-M2的中间载体通过酶切连接，将TRE-PminCMV 连接至 pShuttle-KSL-SV40polyA_KB，并使用Kpn I酶切后，T4 DNA聚合酶补平末端，再用T4 DNA连接酶进行平末端连接，使TRE-PminCMV序列中304位的Kpn I位点消失，获得TRE-KB-PminCMV元件；再将rtTA2S_M2连接到 TRE-KB-PminCMV 的 3’ 端，同样方法使 TRE-KB-PminCMV 与 rtTA2S_M2 间的 EcoR I位点消失，得到带有复合元件TRE-KB-PminCMV-EB-rtTA2S-M2的中间载体pShuttIe-TRE-KB-PminCMV-EB-rtTA2S-M2-SV40polyA。4、构建单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统使用连接酶连接法，将元件5’ -CMV-3’，5’ -TetR-KRAB-3’先后连接到pShuttle-KSL-SV40polyA 上，5’ -SV40polyA_3’ 与 3’ -rtTA2S-M2-TRE-PminCMV_5’ 连接为5’ -SV40polyA-3’ -3’ -rtTA2S-M2-TRE-PminCMV_5’，并一起连接到元件 TetR-KRAB 的 3’端，再将 5’ -Tight-PminCMV-3 连接到 3’ -rtTA2S-M2-TRE-PminCMV_5’ 的 5’ 端，得单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统。单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统在制备治疗结肠癌药物中的用途。有效成分制备El区携带单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统并调控表达目的基因TRAIL的腺病毒载体，制备治疗肿瘤药物用常规注射剂的形式来使用。所述的药用常规制剂含作为活性成分的制备El区携带单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统并调控表达目的基因TRAIL的腺病毒载体，该活性成分在制剂中与药学上可接受的载体如适宜于静脉注射给药的有机或无机液体赋形剂混合。单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统在制备治疗结肠癌药物中的用途，制备El区携带单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统并调控表达目的基因TRAIL的腺病毒载体，制备治疗结肠癌药物以注射液来使用，制备该药物1000支用原料及其配比如下El区携带单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统并调控表达目的基因TRAIL的腺病毒载体2 X IO15Vp注射用水加至2000mL制备方法按药剂学注射剂的常规方法进行。每支2mL，每mL含活性成分El区携带单载体双向启动的Tet-on诱导表达系统并调控表达目的基因TRAIL的腺病毒载体I X IO12Vp。使用时每日I次注射,按瘤体积计算,瘤体<3cm3，用量为2X IO12Vp病毒即I支；3cm3<瘤体<5cm3，用量为3X 1012vp病毒即I. 5支；瘤体>5cm3，用量为4X IO12Vp病毒即2支，每次多点瘤内注射。治疗一个疗程用药连续5天。用药期间同时按常规抗生素用量口服强力霉素。本专利技术改进了 Tet-on诱导表达系统的结构，使全部调控元件和目的基因的表达均构建在了一个载体上，克服2质粒Tet-on系统的低效性，同时对基因表达的调控具有严密性，并能应用于如腺病毒载体等病毒载体，使基因的治疗更为安全和有效。附图说明图I 是载体 pShuttle-KSL-SV40polyA_KB 的构建流程。图2是带有复合元件TRE-KB-Pmin本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种单载体双向启动的Tet？on诱导表达系统，其特征在于：其元件的连接顺序为5？’CMV？TetR？KRAB？SV40polyA？rtTA2S？M2？EB？PminCMV？KB？TRE？Tight？PminCMV？EcoRⅠ？Spe？Ⅰ？SV40polyA？3’，Tight？PminCMV左侧的复合元件rtTA2S？M2？EB？PminCMV？KB？TRE的连接方式为3’？rtTA2S？M2？EB？PminCMV？KB？TRE？5’？5’？Tight？PminCMV？3’，其余元件均按与该系统相同方向5’？3’顺序连接；两个酶切位点EcoR？Ⅰ和SpeⅠ位于元件Tight？PminCMV和元件SV40polyA之间，该系统序列如下：ggtaccaata？gttattaata？gtaatcaatt？acggggtcat？tagttcatag？cccatatatg？？？？？60gagttccgcg？ttacataact？tacggtaaat？ggcccgcctg？gctgaccgcc？caacgacccc？？？？120cgcccattga？cgtcaataat？gacgtatgtt？cccatagtaa？cgccaatagg？gactttccat？？？？180tgacgtcaat？gggtggagta？tttacggtaa？actgcccact？tggcagtaca？tcaagtgtat？？？？240catatgccaa？gtacgccccc？tattgacgtc？aatgacggta？aatggcccgc？ctggcattat？？？？300gcccagtaca？tgaccttatg？ggactttcct？acttggcagt？acatctacgt？attagtcatc？？？？360gctattacca？tggtgatgcg？gttttggcag？tacatcaatg？ggcgtggata？gcggtttgac？？？？420tcacggggat？ttccaagtct？ccaccccatt？gacgtcaatg？ggagtttgtt？ttggcaccaa？？？？480aatcaacggg？actttccaaa？atgtcgtaac？aactccgccc？cattgacgca？aatgggcggt？？？？540aggcgtgtac？ggtgggaggt？ctatataagc？agagctggtt？tagtgaaccg？tcagatcatc？？？？600gatatggcta？gattagataa？aagtaaagtg？attaacagcg？cattagagct？gcttaatgag？？？？660gtcggaatcg？aaggtttaac？aacccgtaaa？ctcgcccaga？agctaggtgt？agagcagcct？？？？720acattgtatt？ggcatgtaaa？aaataagcgg？gctttgctcg？acgccttagc？cattgagatg？？？？780ttagataggc？accatactca？cttttgccct？ttagaagggg？aaagctggca？agatttttta？？？？840cgtaataacg？ctaaaagttt？tagatgtgct？ttactaagtc？atcgcgatgg？agcaaaagta？？？？900catttaggta？cacggcctac？agaaaaacag？tatgaaactc？tcgaaaatca？attagccttt？？？？960ttatgccaac？aaggtttttc？actagagaat？gcattatatg？cactcagcgc？tgtggggcat？？？1020tttactttag？gttgcgtatt？ggaagatcaa？gagcatcaag？tcgctaaaga？agaaagggaa？？？1080acacctacta？ctgatagtat？gccgccatta？ttacgacaag？ctatcgaatt？atttgatcac？？？1140caaggtgcag？agccagcctt？cttattcggc？cttgaattga？tcatatgcgg？attagaaaaa？？？1200caacttaaat？gtgaaagtgg？gtcgccaaaa？aagaagagaa？aggtcgacgg？cggtggtgct？？？1260ttgtctcctc？agcactctgc？tgtcactcaa？ggaagtatca？tcaagaacaa？ggagggcatg？？？...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：夏海滨，陈皓，
申请(专利权)人：陕西师范大学，
类型：发明
国别省市：
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