提供了经遗传修饰的小鼠，其中所述小鼠不能重排和表达内源小鼠免疫球蛋白轻链可变序列，其中所述小鼠仅表达在内源小鼠K基因座处与小鼠κ(K)恒定基因可操作连接的由人免疫球蛋白序列编码的一种或两种人轻链可变结构域，其中所述小鼠表达反向嵌合抗体，所述反向嵌合抗体具有源自仅有的两种人轻链可变区基因区段之一的轻链可变结构域和小鼠K恒定结构域，以及人重链可变结构域和来自内源小鼠重链基因座的小鼠重链恒定结构域。提供了完全为人的双特异性表位结合蛋白，其包括与相同的轻链缔合的两个不同的重链，所述轻链包含源自两种不同的人轻链可变区基因区段之一的可变结构域。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
提供了经遗传修饰的小鼠，其表达具有与多种人可变/小鼠恒定重链缔合的共有人可变/小鼠恒定轻链的抗体。提供了从小鼠B细胞的人可变区基因序列制备人双特异性抗体的方法。
技术介绍
抗体通常包含同二聚重链组分，其中每个重链单体与相同的轻链缔合。需要具有异二聚重链组分的抗体(例如双特异性抗体)作为治疗性抗体。但是已证明了，制备具有能够满意地与双特异性抗体的每个重链缔合的合适的轻链组分的双特异性抗体是有问题的。在一种方案中，可通过调查所有轻链可变结构域的使用统计学、鉴别出人抗体中最常采用的轻链来选择轻链，并在体外将那种轻链与不同特异性的两个重链进行配对。 在另一种方案中，可通过观察噬菌体展示文库(例如，包含人轻链可变区序列的噬菌体展示文库，例如人ScFv文库)中的轻链序列并从所述文库中选择最常使用的轻链可变区而选择轻链。然后，可在两种不同的目的重链上测试所述轻链。在另一种方案中，可通过使用两种目的重链的重链可变序列作为探针来测定轻链可变序列的噬菌体展示文库而选择轻链。与两种重链可变序列都缔合的轻链可被选作用于所述重链的轻链。在另一种方案中，可将候选轻链与重链的共有轻链进行比对，并在所述轻链中进行修饰以更紧密地匹配两种重链的共有轻链共同的序列特征。如果需要使得免疫原性的机会最小化，则所述修饰优选产生在已知人轻链序列中存在的序列，从而基于评估免疫原性可能性的领域中已知的参数和方法(即计算机模拟和湿测定)，蛋白水解加工不太可能产生T细胞表位。所有上述的方案都依赖于体外方法，其包含若干事先的约束，例如序列同一丨I"生，与特定的、预先选择的重链相缔合的能力等。本领域中需要这样的组合物和方法，其不依赖于操控体外条件，而是采用更为生物学上可感知的方案，来制备包括共有轻链的人表位结合蛋白。附图说明图I描绘了用人Vk 1-39Jk 5基因区域替换内源小鼠免疫球蛋白轻链可变区基因区段的靶向策略。图2描绘了用人Vk 3-20JK I基因区域替换内源小鼠免疫球蛋白轻链可变区基因区段的靶向策略。图3描绘了用人VpreB/JX 5基因区域替换内源小鼠免疫球蛋白轻链可变区基因区段的靶向策略。专利技术概述提供了表达人免疫球蛋白重链和轻链可变结构域的经遗传修饰的小鼠，其中小鼠具有有限的轻链可变集合(repertoire)。提供了用于产生人轻链可变结构域的生物学系统，其中所述人轻链可变结构域与众多集合的亲和-成熟的人重链可变结构域相缔合并一起表达。提供了用于制备包含免疫球蛋白可变结构域的结合蛋白的方法，所述方法包括用目的抗原免疫接种具有有限的免疫球蛋白轻链集合的小鼠，和在特异性结合所述目的抗原的结合蛋白中采用小鼠的免疫球蛋白可变区基因序列。所述方法包括下列方法用于制备适于在制备多特异性抗原结合蛋白中使用的人免疫球蛋白重链可变结构域的方法。提供了经遗传工程化的小鼠，其选择源自未重排的人重链可变区基因区段的集合的、合适的亲和-成熟的人免疫球蛋白重链可变结构域，其中所述亲和-成熟的人重链可变结构域与源自一个人轻链可变区基因区段的单一人轻链可变结构域相缔合并一起表达。提供了经遗传工程化的小鼠，其提供两种人轻链可变区基因区段的选择。提供了经遗传工程化的小鼠，其表达人轻链可变结构域的有限的集合，或者来自人轻链可变区基因区段的有限的集合的单一人轻链可变结构域。所述小鼠经遗传工程化以包括单一的未重排的人轻链可变区基因区段(或两个人轻链可变区基因区段)，其重排以形成表达单一轻链(或表达两条轻链中的任一条或两条)的、经重排的人轻链可变区基因(或两个重排的轻链可变区基因)。经重排的人轻链可变结构域能够与由小鼠选择的多个 亲和-成熟的人重链配对，其中所述重链可变区特异性地结合不同的表位。一方面，提供了经遗传修饰的小鼠，其包括单一的人免疫球蛋白轻链可变(VL)区基因区段，所述基因区段能够重排并编码免疫球蛋白轻链的人VL结构域。另一方面，所述小鼠包括不多于两个人VL基因区段，所述区段能够重排并编码免疫球蛋白轻链的人VL结构域。一方面，提供了经遗传修饰的小鼠，其包括单一经重排的(V/J)人免疫球蛋白轻链可变(VL)区区段(即V/J区段)，所述区段编码免疫球蛋白轻链的人VL结构域。另一方面，所述小鼠包括不多于两个重排的人VL基因区段，所述区段能够编码免疫球蛋白轻链的人VL结构域。在一个实施方案中，所述VL基因区段是人VK 1-39J k 5基因区段或人Vk 3-20JK I基因区段。在一个实施方案中，所述小鼠具有人V K 1-39JK 5基因区段和人Vk 3-20JK I基因区段两者。在一个实施方案中，所述人VL基因区段与人或小鼠前导序列可操作地连接。在一个实施方案中，所述前导序列是小鼠前导序列。在具体的实施方案中，所述小鼠前导序列是小鼠V K 3-7前导序列。在一个实施方案中，所述VL基因区段与免疫球蛋白启动子序列可操作地连接。在一个实施方案中，所述启动子序列是人启动子序列。在具体的实施方案中，所述人免疫球蛋白启动子是V K 3-15启动子。在一个实施方案中，所述经遗传修饰的小鼠包含VL基因座，其不包含能够重排以形成免疫球蛋白轻链基因的内源小鼠VL基因区段，其中所述VL基因座包含能够重排以编码轻链基因的VL区的单一人VL基因区段。在具体的实施方案中，所述人VL基因区段是人Vk 1-3町1^5基因区段或人￥1^3-2(^1^ I基因区段。在一个实施方案中，所述VL基因座包括前导序列，其5’侧翼(相对于VL基因区段的转录方向)是人免疫球蛋白启动子，而3’侧翼是人VL基因区段，所述人VL基因区段重排并编码包含内源小鼠轻链恒定区(CL)的反向嵌合轻链的VL结构域。在具体的实施方案中，所述VL基因区段位于小鼠K VL基因座，且小鼠CL是小鼠kCL。在一个实施方案中，所述小鼠包括无功能的\免疫球蛋白轻链基因座。在具体的实施方案中，所述、基因座包括所述基因座的一个或多个序列的缺失，其中所述一个或多个缺失使得所述、基因座不能重排以形成轻链基因。在另一个实施方案中，所述、基因座的全部或其本上全部VL基因区段都缺失。在一个实施方案中，经修饰的小鼠的VL基因座是K基因座，并且所述K基因座包括小鼠K内含子增强子(intronic enhancer)，小鼠k 3’增强子，或内含子增强子和3’增强子二者。在一个实施方案中，小鼠制造这样的轻链其包含源自人VL基因区段的、体细胞突变的VL结构域。在一个实施方案中，所述轻链包含源自人VL基因区段的、体细胞突变的 VL结构域，和小鼠K CL区域。在一个实施方案中,所述小鼠不表达\轻链。在一个实施方案中，所述遗传修饰的小鼠能够体细胞超突变人VL区域序列。在具体的实施方案中，所述小鼠包括这样的细胞其包含源自能够重排和编码VL结构域的人VL基因区段的重排的免疫球蛋白轻链基因，并且所述重排的免疫球蛋白轻链基因包含体细胞突变的VL结构域。在一个实施方案中，所述小鼠包括这样的细胞其表达包含与小鼠K CL相连的体细胞突变的人VL结构域的轻链，其中所述轻链与包含源自人VH基因区段的、体细胞突变的VH结构域的重链相缔合，并且其中所述重链包含小鼠重链恒定区(CH)。在一个实施方案中，所述小鼠包含用一个或多个人VH基因区段对内源小鼠VH基因区段的替换，其中人VH基因区段与本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：J·麦克沃克，L·麦克唐纳，S·史蒂文斯，S·戴维斯，A·J·莫菲，D·R·巴克勒，
申请(专利权)人：瑞泽恩制药公司，
类型：发明
国别省市：
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