猪LepR基因敲除打靶载体、其构建方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种猪LepR基因敲除打靶载体、其构建方法及应用。本发明专利技术提供的猪LepR基因敲除打靶载体，通过同源重组的方式用自我删除元件LOCN替换猪LepR基因第三外显子及其两端的一小段内含子序列，使所有LepR蛋白亚型都缺失信号肽序列，从而真正消除了LepR的信号转导功能，该载体的成功构建既能实现LepR基因敲除猪模型的制备，又为LepR功能的研究及肥胖症治疗药物的开发奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
猪LepR基因敲除打靶载体、其构建方法及应用
本专利技术属于基因工程
，具体地说，涉及一种猪LepR基因敲除打靶载体、其构建方法及应用。
技术介绍
1995年，Tartaglia等首次在小鼠脉络丛细胞中发现瘦素受体(Obesegenereceptor,ob-R；或Leptinreceptor,LepR)，随后通过遗传图谱连锁分析，将小鼠LepR基因定位于4号染色体(5.1CM)，该区域包含db/db突变。人LepR基因定位于1号染色体p臂(31)，猪LepR基因定位于6号染色体q臂(33-35)，研究发现该区域与人和小鼠LepR基因所在位置是同源区。此外，猪LepR基因与人和鼠LepR基因的核苷酸序列同源性分别为89.3％和80.3％，氨基酸同源性分别为80.3％和76.6％，表明LepR基因在猪、人和鼠中保守性较强。根据LepR基因的保守性，可以建立动物模型，研究LepR基因的功能、人类肥胖病因和预防治疗。瘦素受体是由db(diabetes)基因编码，由于db基因的不同拼接形式，引起瘦素受体mRNA的多种变化，到目前为止，在小鼠和人体内至少发现了六种瘦素受体拼接异构体(splicedisoform)—Ob-Ra-f，而在猪体内只检测到两种瘦素受体拼接异构体——Ob-Ra和Ob-Rb。而这些瘦素受体按照结构可分为3个区：胞外区，由810多个氨基酸构成，是Leptin蛋白的结合部位；跨膜区以及一般由34个氨基酸构成多变的胞内区，根据结构可将其分成短受体亚型(ObRS)和长受体亚型(ObRL)两种，其中Ob-Rb属于长受体亚型，胞内区有302个氨基酸，其它几种瘦素受体拼接异构体均属于短型受体亚型。除了Ob-Re(最短，缺少跨膜片段，仅含808个氨基酸，唯一的可溶性受体)，Ob-Ra-d和Ob-Rf均为单一跨膜受体，而且它们具有相同的胞外区和跨膜区。瘦素受体的胞外区具有I型细胞因子受体家族的特点，包含两个细胞因子样的结合特征序列(色氨酸-丝氨酸-X-色氨酸-丝氨酸)和一个纤维连结蛋白类III区域，与白介素-6(IL-6)受体的信号传导成分糖蛋白(GP130)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)受体、白细胞抑制因子(leukemiainhibitoryfactor,LIF)受体密切相关。LepR介导的信号主要是被Leptin蛋白诱发的受体同型二聚体化激发的。当瘦蛋白与其受体结合后，受体同型二聚体化导致结合到受体的JAK2被激活，活化的JAK2使受体胞内Tyrll38磷酸化，受体通过磷酸化的酪氨酸残基与STAT3作用，激活STAT3，活化的STAT3分子形成二聚体，从复合物中解离，并被转运到细胞核内，启动特定基因的表达，转录并翻译特定蛋白，从而发挥瘦蛋白的生物学效应。通过构建LepR基因敲除动物模型，对LepR基因的功能进行深入研究，可揭示LepR影响脂肪沉积的分子机制，从而实现通过LepR来调节体内能量平衡，控制体脂沉积，从而实现治疗肥胖症。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种猪LepR基因敲除打靶载体、其构建方法及应用。为了实现本专利技术目的，本专利技术的一种猪LepR基因敲除打靶载体，所述打靶载体中含有以下功能元件：自我删除元件LOCN、负筛选标记基因表达元件和复制起始序列ori以及猪LepR基因第三外显子上游同源左臂和下游同源右臂；其中，负筛选标记基因表达元件、同源左臂、自我删除元件LOCN和同源右臂依次连接。所述自我删除元件LOCN为：LoxP-小鼠Oct4启动子-重组酶Cre基因-核定位信号序列NLS-终止子-正筛选标记基因表达元件-LoxP。所述负筛选标记基因表达元件包括小鼠PGK启动子及由其驱动的负筛选标记基因DTA；所述正筛选标记基因表达元件包括小鼠PolII启动子及由其驱动的正筛选标记基因Neo。本专利技术通过常规测序获知猪LepR基因的部分核苷酸序列(第三外显子上游约6.3kb、第三外显子和第三外显子下游约10kb)，将第三外显子上游一段约2kb序列作为同源左臂(同源短臂)，下游一段约5.3kb序列作为同源右臂(同源长臂)，使用PCR高保真酶扩增同源左臂和同源右臂；使用PCR高保真酶扩增1.6kb的负筛选标记基因表达元件，连接到同源左臂5’端。其中，用于PCR扩增猪LepR基因第三外显子上游同源左臂的引物序列如SEQIDNO.2和3所示；用于PCR扩增猪LepR基因第三外显子下游同源右臂的引物序列如SEQIDNO.4和5所示；用于PCR扩增负筛选标记基因表达元件的引物序列如SEQIDNO.10和11所示。用于构建本专利技术猪LepR基因敲除打靶载体的骨架载体为pL452。构建获得的打靶载体的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供所述打靶载体的构建方法，以pL452为骨架载体，依次将负筛选标记基因表达元件、同源左臂和同源右臂插入载体pL452中；然后用自我删除元件LOCN置换载体pL452中的LoxP-PGK-Neo-LoxP元件，即得。本专利技术还提供所述打靶载体在制备猪LepR基因敲除动物模型中的应用。所述应用具体为：将所述打靶载体转染猪胎儿成纤维细胞，通过正负筛选获得中靶的阳性克隆细胞系，以所述阳性克隆细胞系为核移植供体细胞，成熟的猪卵母细胞为核移植受体细胞，通过体细胞核移植技术获得克隆胚胎；将克隆胚胎移入发情期的受体母猪子宫内妊娠，获得LepR基因敲除F0代猪，将所得F0代猪进行杂交繁育，获得的纯合子作为猪LepR基因敲除动物模型(LepR基因敲除猪模型)。本专利技术进一步提供一种猪LepR基因敲除前体细胞系，所述细胞系的制备方法为：将所述打靶载体转染猪胎儿成纤维细胞，通过左、右同源臂与细胞基因组进行同源重组，用自我删除元件LOCN替换猪LepR基因第三外显子及其两端的一小段内含子序列，获得中靶阳性细胞克隆，即为猪LepR基因敲除前体细胞系。其中，用于鉴定所述阳性细胞克隆的特异性PCR引物组合为：跨同源左臂PCR鉴定引物对(SEQIDNO.6和7)：F：5’-TCAGATTCATTTTTGCTTTGCCACG-3’R：5’-CCTGTCTGCAAGGGATGGTGTTTGT-3’跨同源右臂PCR鉴定引物对(SEQIDNO.8和9)：F：5’-CAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTC-3’R：5’-CTCTGGTCCCTGGTAGCCATCATTC-3’。本专利技术还提供所述猪LepR基因敲除前体细胞系在制备猪LepR基因敲除动物模型中的应用。所述应用具体为：以所述猪LepR基因敲除前体细胞系为核移植供体细胞，成熟的猪卵母细胞为核移植受体细胞，通过体细胞核移植技术获得克隆胚胎；将克隆胚胎移入发情期的受体母猪子宫内妊娠，获得LepR基因敲除猪，将所得LepR基因敲除猪进行杂交繁育，获得的纯合子作为猪LepR基因敲除动物模型。本专利技术提供的猪LepR基因敲除打靶载体，通过敲除猪LepR基因第三外显子及其两端的一小段内含子序列，使所有LepR蛋白亚型都缺失信号肽序列，从而真正消除了LepR的信号转导功能，该载体的成功构建既能实现LepR基因敲除猪模型的制备，又为LepR基因功能的研究及肥胖症治疗药物开发奠定了基础。其中自我删除元件LOCN在体细胞核移植过程中的猪早期胚胎发育本文档来自技高网...

【技术保护点】
猪LepR基因敲除打靶载体，其特征在于，所述打靶载体中含有以下功能元件：自我删除元件LOCN、负筛选标记基因表达元件和复制起始序列ori以及猪LepR基因第三外显子上游同源左臂和下游同源右臂；其中，负筛选标记基因表达元件、同源左臂、自我删除元件LOCN和同源右臂依次连接；所述自我删除元件LOCN为：LoxP‑小鼠Oct4启动子‑重组酶Cre基因‑核定位信号序列NLS‑终止子‑正筛选标记基因表达元件‑LoxP。

【技术特征摘要】
1.猪LepR基因敲除打靶载体，其特征在于，所述打靶载体中含有以下功能元件：自我删除元件LOCN、负筛选标记基因表达元件和复制起始序列ori以及猪LepR基因第三外显子上游同源左臂和下游同源右臂；其中，负筛选标记基因表达元件、同源左臂、自我删除元件LOCN和同源右臂依次连接；所述自我删除元件LOCN为：LoxP-小鼠Oct4启动子-重组酶Cre基因-核定位信号序列NLS-终止子-正筛选标记基因表达元件-LoxP。2.根据权利要求1所述的打靶载体，其特征在于，所述负筛选标记基因表达元件包括小鼠PGK启动子及由其驱动的负筛选标记基因DTA；所述正筛选标记基因表达元件包括小鼠PolII启动子及由其驱动的正筛选标记基因Neo。3.根据权利要求1所述的打靶载体，其特征在于，用于PCR扩增猪LepR基因第三外显子上游同源左臂的引物序列如SEQIDNO.2和3所示；用于PCR扩增猪LepR基因第三外显子下游同源右臂的引物序列如SEQIDNO.4和5所示。4.根据权利要求1-3任一项所述的打靶载体，其特征在于，骨架载体为pL452。5.根据权利要求4所述的打靶载体，其特征在于，所述打靶载体的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。6.权利要求5所述打靶载体的构建方法，其特征在于，以pL452为骨架载体，依次将负筛选标记基因表达元件、同源左臂和同源右臂插入载体pL452中；然后用自我删除元件LOCN置换载体pL452中的LoxP-...

【专利技术属性】
技术研发人员：李秋艳，沈良才，李向清，李志远，付怡静，王一丁，王牧宁，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11