本发明专利技术公开了携带qepA3新基因的质粒片段，其序列如SEQ ID NO.1所示。该段质粒是在一种大肠杆菌EC3157的基因组中发现的。因此本发明专利技术的上述质粒片段的发现，一方面对从基因水平上探讨细菌耐药性转移的分子机制具有重要的理论和实践意义；另一方面为临床用药提供了一定的指导作用，有利于临床上减少某些抗菌药物的使用，降低该类耐药基因转移的选择压力，防止耐药细菌的爆发性流行。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学技术及耐药细菌监测领域，涉及一段新发现的与大肠埃希 菌耐药性密切相关的质粒。
技术介绍
大肠杆菌是医学和兽医临床上最常见的病原菌之一，给人类的健康和畜牧业的发 展造成了严重的损害。抗菌药在控制大肠杆菌感染方面发挥了重要作用，但随着抗菌药物 的广泛应用，耐药菌株迅速出现，多重耐药现象十分普遍，特别是质粒介导的大肠杆菌引起 的多重耐药已成为威胁全球医学及公共卫生的严重问题。 根据文献报道，由质粒介导的喹诺酮类耐药机制有：qnr基因因素、氨基糖苷类乙 酰转移酶aac (6'）-Ib-cr基因因素以及对喹诺酮类药物敏感性降低的q印A和oqxAB外 排栗基因等因素。q印A1基因首次在2007年被日本和比利时研究人员前后发现，接着，在 2008年q印A2基因被法国研究人员发现，从此，q印A1和q印A2基因在世界各地普遍地被报 道。虽然韩国研究人员披露在韩国qepA基因有很低的流行性，但我国研究人员发现在携带 肠杆菌的食源性动物如猪、鸡、鸭身上普遍发现q印A基因，这样，潜在的q印A基因传播和感 染，甚至爆发具有极大地可能性，因此对qnr、aac (6'）-Ib-cr和qepA及oqxAB基因的检测 和监测也已经具有迫切的实际需要和意义。 从2008年发现qepA2基因至今，再也没有其它的qepA等位基因发现。但是，在 2013年9月，我们在浙江省台州市立医院一个I⑶住院病人的血液中分离到携带q印A新等 位基因的大肠埃希氏菌，经美国Lahey Clinic的George A. Jacoby教授核实，将其命名为 新qepA3新基因，GenBank登录号JQ064560。同时进一步研究了 qepA3所在质粒的长度及 其q印A3上下游序列多个基因的结构，证明该菌株对抗生素多重耐药原因是由于该菌株存 在多种抗生素耐药基因共同作用的结果。
技术实现思路
本专利技术提供了一段含有携带q印A3新基因及其上下游序列的质粒片段PEC3157， qepA3新基因的上下游序列中含有多种抗生素耐药基因。质粒片段pEC3157的序列如SEQ ID NO. 1所示。该段质粒两端含有缩短的tnpA(IS26)基因与缩短的tnpR基因、blaCTXM 14 基因、rmtB基因、tnpA基因（ISCR3C)、qepA3新基因、dfr2基因片段和缩短的intll-groEL 融合基因连接。正是上述多种耐药基因的表达，导致含有该段质粒的菌种对多种抗生素药 物具有耐药性。这些抗生素包括：氨基糖苷类抗生素、0内酰胺类抗生素以及喹诺酮类抗 生素耐药。 常见的氨基糖苷类抗生素包括：链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、阿米卡 星。 常见的e内酰胺类抗生素包括：青霉素、头孢菌素，以及新发展的头霉素类、单环 0-内酰胺类等其他非典型0-内酰胺类抗生素。 常见的喹诺酮类抗生素抗生素包括：萘啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星。 本专利技术的质粒片段是通过以下方法获得的： (1)在台州市立医院ICU病人血液培养阳性的标本中分离出1株对头孢曲松、阿米 卡星、环丙沙星耐药的细菌。 (2)将分离的单克隆菌株按操作程序用VITEK 2和药敏平板琼脂扩散方法进行细 菌鉴定及药敏试验，经鉴定此菌株为大肠埃希氏菌，将其命名为EC3157。同时，实验证实此 菌株对多种抗生素有显著耐药性。 (3)将EC3157菌株培养扩增，提取所述耐药菌株的质粒。 (4)将步骤（3)提取纯化后的质粒使用Dral和BamHI酶切，琼脂糖凝胶电泳分离 分别得到两段长度为4, 567bp和6, 198bp的DNA片段。将该两DNA片段以常规方法分别与 PMD19-T载体连接，然后热激转化法转入感受态细胞E. coli T0P10中，以蓝白斑实验挑选 阳性转化子，分别测序。 (5)通过序列装配组合，得到如SEQ ID NO. 1所示序列。 本专利技术还提供了含有质粒片段PEC3157的重组质粒。所述重组质粒包含q印A3 新基因及其上下游基因序列。在本专利技术的具体的实施方案中，所述重组质粒由上述两部分 DNA序列和pET32a载体重组而成，重组质粒插入位点在pET32a载体上Dral和BamHI酶切 位点处。并将其转化入野生型E. coli JM109中，通过含有Amp的平板选阳性克隆（含有 pET32a-重组质粒的细菌）。将阳性克隆做药敏试验，结果显示EC3157菌株中的这两段重 组质粒可以使重组E. coli JM109菌株对以下药物耐药：阿米卡星、妥布霉素、丁胺卡拉、庆 大霉素、头孢替坦、头孢唑林、头孢吡肟、头孢他啶、头孢曲松、萘啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星、 环丙沙星。 本专利技术还提供了含有携带q印A3新基因质粒片段的接合菌株。为了研究该DNA 的耐药性，本专利技术利用细菌质粒转导实验来鉴定携带qepA3新基因的质粒片段的功能，将 EC3157菌株与E. coli J53 AzR(对叠氮化钠耐药）菌株共培养，通过含叠氮化钠（300mg/ L)和阿米卡星（0.06mg/L)平板筛选接合子，将接合子做药敏试验，受体菌拥有供体菌的耐 药性。其中，所用阿米卡星可用下列药物代替：氨曲南、妥布霉素、丁胺卡拉、庆大霉素、头孢 替坦、头孢唑林、头孢吡肟、头孢他啶、头孢曲松。 本专利技术的优点和有益效果： (1)本专利技术首次发现了序列为SEQ ID NO. 1的包括多种耐药基因的携带q印A3新 基因的质粒片段，该段质粒的核苷酸序列在现有技术中未见报道。 (2)本专利技术的发现，为临床用药提供了一定的指导作用。有利于临床上减少某些抗 菌药物的使用，防止耐药细菌的爆发性流行。【附图说明】 图1为本专利技术的携带qepA3新基因质粒片段的结构示意图。 具体的实施方式 下面结合具体的实施例进一步说明本专利技术，本专利技术的实施例仅用于解释本专利技术， 并不意味着限制本专利技术的保护范围。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人， 分子克隆：实验室手册（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所描 述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 实施例1携带qepA3新基因的质粒片段的鉴定 1、EC3157菌株的分离和鉴定 1. 1材料 细菌药敏卡：法国bioMerieux的AST-GN13。AST-GN13药敏种类有：阿米卡星、氨 苄西林、氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、头孢唑啉、头孢吡肟、头孢替坦、头孢他定、头孢曲松、 环丙沙星、厄他培南、庆大霉素、亚胺培南、左氧氟沙星、呋喃妥因、哌拉西林/他唑巴坦、妥 布霉素。 1. 2 方法 仪器鉴定：将台州市立医院I⑶病人血液培养阳性的菌株转种到血平板上分离培 养（在35°C含5% C0J?育箱中培养16-18h)，然后将分离的纯细菌按操作程序在VITEK 2 上机作细菌鉴定与药敏试验。 补充药敏试验：将0. 5麦氏单位的菌液涂抹在MH平板上，按操作程序贴上头孢哌 酮/舒巴坦、复方新诺明和氯霉素纸片，在35°C含5% C0J?育箱中培养16-18h后，按CLSI 2012标准鉴定药敏结果。 1. 3 结果 1. 3. 1仪器鉴定结果 经VI本文档来自技高网...
【技术保护点】
携带qepA3新基因的质粒片段，其特征在于，所述质粒片段的序列如SEQ ID NO.1所示，所述质粒片段命名为pEC3157。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王冬国，陶国仙，阮桂英，陈佳玉，
申请(专利权)人：王冬国，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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