本发明专利技术涉及一种条件性基因敲除动物模型的快速构建方法，其是采用CRISPR/Cas9技术完成的。具体方法可以为：设计CRISPR/Cas9系统针对动物待敲除基因的gRNA靶点序列，设计相应的启动子，构建质粒，实现条件性基因敲除。其可以实现快速有效、简单易行、经济高效、适用范围广的条件性基因敲除动物模型的构建，可以解决上述传统方法(特异性重组酶系统Cre-LoxP)的缺陷。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因编辑
，尤其是涉及一种条件性基因敲除动物模型的快速 构建方法以及其应用。
技术介绍
CRISPR(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat sequences)/Cas9系统是一种新型的基因编辑技术。该技术利用具有引导作用的 sgRNA(shortguideRNA)与基因组DNA革E1序列特异性结合，招募具有内切酶功能的Cas9蛋 白对目标靶点进行切割。DNA双链被切开后，残端在没有同源序列时以非同源末端连接的方 式修复或是存在同源序列时以同源重组的方式修复。修复过程会出现碱基缺失或增添导致 基因失活。CRIPSR/Cas9技术已实现果蝇、斑马鱼、小鼠、大鼠、猴、人等多个物种的基因敲 除，并广泛应用于基因编辑的其他方面，如基因敲入、定点整合及缺失、定点突变等。相比于 其他基因编辑系统如TALENs，ZFNs等核酸酶技术，CRISPR/Cas9在基因组中有丰富的靶点， 设计容易，操作简单，敲除效率高，经济成本低，并且能够实现多个基因同时敲除等优点，在 基因敲除动物模型构建以及疾病模型的构建和治疗领域具有非常广泛的应用前景。 通过显微注射将DNA注射到小鼠受精卵中，然后移植到孕鼠的囊胚中，能发育成 转基因的嵌合体，后代可以得到转基因的动物，通过这种方法可以将目的基因快速导入小 鼠体内。利用这种方法可以快速将CRISPR/Cas9系统整合到小鼠基因组中。 目前条件性基因敲除动物模型主要是通过特异性重组酶系统Cre-LoxP(或 Flp-Frt)来实现的，将带有特定flox位点的转基因小鼠与细胞特异性表达的Cre酶的转基 因小鼠杂交可以获得特定组织细胞中基因敲除的小鼠。更换Cre酶的基因的启动子可以实 现多种条件（如药物诱导、特定时间、特定组织等）下基因敲除。但是这种条件性基因敲除 的方法需要同时构建两个转基因小鼠（flox小鼠和Cre小鼠），而且条件性基因敲除小鼠只 能通过flox小鼠和Cre小鼠杂交而来，获得条件性基因敲除的纯合小鼠周期较长，成本较 高，操作复杂。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种简单易行、经济高效、适用范围广的条件性基因敲除动 物模型的快速构建方法及其应用。 为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案： 一种条件性基因敲除动物模型的快速构建方法，其是采用CRISPR/Cas9技术完成 的。具体方法可以为：设计CRISPR/Cas9系统针对动物待敲除基因的gRNA靶点序列，设计 相应的启动子，构建质粒，实现条件性基因敲除。其可以实现快速有效、简单易行的条件性 基因敲除动物模型的构建，可以解决上述传统方法（特异性重组酶系统Cre-LoxP)的缺陷。 根据本专利技术的一个优选实施方案，本专利技术的构建方法可以用于小鼠骨组织特异性 Y谷氨酸羧化酶基因（GGCX)敲除小鼠模型的快速构建。但是本领域技术人员都可以理解 的是，在更换GGCX的gRNA序列后，能够同时敲除多个基因。在更换骨特异性的启动子后， 可实现在其他组织中特异性的基因敲除。 进一步地，本专利技术提供一种小鼠骨组织特异性Y谷氨酸羧化酶基因敲除小鼠模 型的快速构建方法，设计CRISPR/Cas9系统针对小鼠GGCX基因的gRNA靶点序列，设计相 应的启动子，构建质粒，实现GGCX基因敲除；其中CRISPR/Cas9系统针对小鼠GGCX基因的 gRNA靶点为两个，其序列如SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 2所示。所述SEQIDNO. 1和SEQ IDNO. 2分别是针对GGCX外显子一和外显子二的gRNA靶点。 其中所述启动子优选为小鼠骨特异性Osterix启动子，序列如SEQIDNO.19所 不〇 其中所述CRISPR/Cas9系统中的Cas9质粒，优选包括Cas9基因及核定位信号序 列，含有如SEQIDNO. 10所不的喊基序列。 在上述基础上，本专利技术提供的最优选的用于条件性敲除小鼠GGCX基因的质粒， 为Posterix-Cas9-gRNAl-gRNA2,质粒图谱见附图7所示。所述条件性基因敲除质粒 Poster ix-Cas9-gRNAl-gRNA2，利用受精卵显微注射的方法整合到小鼠基因组中，获得条件 性基因敲除的后代。 本专利技术的方法具有以下优点： 1、只需构建一只转基因小鼠就可以实现条件性基因敲除。避免了Cre小鼠和flox 小鼠复杂的杂交过程。 2、构建用于条件性基因敲除的转基因小鼠，可实现在骨组织中特异性的敲除GGCX 基因。 3、在更换GGCX的gRNA序列后，能够同时敲除多个基因。在更换骨特异性的启动 子后，可实现在其他组织中特异性的基因敲除。 4、基因敲除周期缩短，经济成本显著减小。 利用本专利技术可以快速实现多个物种多种条件性基因敲除。获得的条件性基因敲除 动物遗传背景清晰，能够稳定遗传，能够广泛应用于基因功能的研宄和各种疾病模型的构 建。 上述说明仅是本专利技术技术方案的概述，为了能够更清楚了解本专利技术的技术手段， 并可依照说明书的内容予以实施，以下以本专利技术的较佳实施例并配合附图详细说明如后。【附图说明】 图1是CRISPR/Cas9系统针对GGCX靶点序列及位置示意图，大写为外显子序列， 小写为内含子序列； 图2是gRNA活性验证测序峰图； 图3是三个CMV-Cas9_gRNA质粒示意图； 图4是三个CMV-Cas9_gRNA质粒活性验证测序峰图； 图5是三个CMV-Cas9_gRNA质粒剪切电泳图； 图6是三个CMV-Cas9_gRNA质粒剪切测序图； 图7是0SX-Cas9-gRNAl-gRNA2质粒图谱；图8是0SX-Cas9_gRNA质粒剪切测序图； 图9是转基因OSX-Cas9_gRNA质粒线性化电泳图； 图10是OSX-Cas9_gRNA转基因小鼠鉴定图； 图11是OSX-Cas9-gRNA转基因小鼠骨GGCX敲除电泳鉴定图； 图12是OSX-Cas9-gRNA转基因小鼠骨GGCX敲除测序鉴定分析图。【具体实施方式】 下面结合附图和实施例，对本专利技术的【具体实施方式】作进一步详细描述。以下实施 例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。 所涉及的化学试剂或生物制品，如未特别说明都为商业化产品。另外，其他未注明 的实验操作按照常规分子生物学操作方法进行。 实施例1 针对小鼠GGCX设计gRNA靶点 参照gRNA设计原则，针对Y谷氨酸羧化酶（GGCX)第一个和第二个外显子分别设 计gRNAl和gRNA2祀点，序列如下所示： gRNA靶点1 :GAGCAACCAGTGCGGAGCCG(如SEQ ID NO. 1所示） gRNA靶点2 :GCCAGGITTGCAGGGTCCGT(如SEQ ID NO. 2所示） 详细信息如图1所示。 构建gRNA载体 1、gRNA空载体酶切 gRNA空载体从addgene公司购买。gRNA空载体连在pCR?-_Blunt II-TOPO? 载体中。使用Afl II酶（NEB)酶切，胶回收酶切片段一。 gRNA空载体序列：如SEQ ID NO. 3所示。 2、构建gRNA靶点序列插入片段 1)设计引物序列如下： gRNAl上游引物gRNAl-F(如SEQ ID NO. 4所示）：本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种条件性基因敲除动物模型的快速构建方法，其特征在于：采用CRISPR/Cas9技术。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：戴钟铨，梁培龙，曹宏卿，吴峰，杨超，张洪玉，李金桥，陈键，万玉民，李莹辉，
申请(专利权)人：中国航天员科研训练中心，
类型：发明
国别省市：北京;11
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