羊草盐碱胁迫诱导14-3-3蛋白基因制造技术

羊草盐碱胁迫诱导14-3-3蛋白基因，它属于基因工程技术领域。本发明专利技术通过RACE法克隆获得耐盐碱能力极强的羊草的一种盐碱胁迫应答基因-14-3-3蛋白基因全长序列，然后，通过Northern检测和遗传转化检测其在盐碱胁迫下表达情况，分析它是否与抗盐碱胁迫相关。本发明专利技术获得的14-3-3蛋白基因编码区786bp，编码262个氨基酸。与禾本科其它植物大麦、小麦等相比同源性较高，DNA序列有约10％的差异，氨基酸序列有5％的差异，本发明专利技术获得的羊草14-3-3蛋白基因未见基因登录信息及相关序列信息报道。本发明专利技术所得基因Northern杂交显示其与植物抗盐碱胁迫相关。转化到露地菊后，转基因露地菊可以在含100mmol/L～200mmol/L?NaCl的培养基上正常生长，根、植株生长情况明显好于未转化植株，且表现出较好的抗盐碱特性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程
，涉及一种羊草的盐碱胁迫诱导蛋白基因。
技术介绍
将植物转基因技术应用于强耐盐碱植物的培育是一种有效的途径，已经有各种基因获得专利的报道。目前，应用于农作物分子育种的抗盐碱基因多来源于非盐生的模式植物拟南芥、水稻等植物中，虽然通过转基因过量表达有提高作物抗逆性的报道，但是其转基因效率及功能尚有待提高。我国大部分地区盐碱化土壤多为氯化盐(Cl_)盐碱土，这种土壤主要表现为盐化影响，即Na+对植物的胁迫，而东北地区盐碱地的突出特点是不仅存在氯化盐(Cl—)盐碱土， 还有大面积的碳酸盐OD32-)盐碱土，即不仅存在高盐离子而且同时伴有高pH危害。目前， 对植物耐盐碱的研究还大多集中于植物耐NaCl盐性，而对植物耐碱性特别是耐碳酸盐(高 pH)研究还亟待深入。羊草(Leymus chinensis)属禾本科赖草属植物，是一种广布于东北地区的优良牧草，尤其突出的是羊草具有较强的耐盐碱性，长期的盐碱地条件下生长的羊草具有了一系列适应盐碱环境的优良特性，其中蕴藏着大量的抗逆基因，是进行抗性基因筛选的良好材料。
技术实现思路
本专利技术目的是为了解决现有耐盐基因转化获得的耐盐转基因植物的耐盐能力不高的问题，克隆一种抗盐碱能力强的牧草羊草的一种盐碱胁迫应答基因一羊草(Leymus chinensis)碱胁迫诱导14_3_3蛋白基因。这种抗逆相关基因可以用于科研与生产中，用于其详细的抗性机理等方面的研究，并通过转基因技术来培育抗逆植物新品种。羊草是一种广泛分布于东北地区的优良牧草，被称为“牧草中的细粮”。另外，羊草还具有突出的耐盐碱性，可在黑龙江的盐碱土壤地区种植，长期的盐碱地条件下生长的羊草具有了一系列适应盐碱环境的优良特性，其中蕴藏着大量的抗逆基因。长期以来，对羊草的研究主要集中在生态学、生殖生物学方面，而针对羊草的抗盐碱特性的研究也主要集中在生理学指标的测定上，但从分子生物学角度对羊草抗盐碱特性进行研究还比较少，远不能满足对其相关特性分子水平研究的要求。本专利技术通过克隆出抗盐碱能力很强的羊草的一种盐碱胁迫应答基因-盐碱胁迫诱导14-3-3蛋白基因，然后通过Northern杂交和遗传转化技术检测其在盐碱胁迫下的表达情况，分析它是否与植物的抗盐碱能力相关。本专利技术的基因编码区长786bp，编码262个氨基酸。经序列同源性blast分析表明，与禾本科植物大麦、小麦等相比同源性较高，DNA序列有约10%的差异，氨基酸序列差异小于5%，本专利技术获得的羊草 14-3-3蛋白基因未见基因登录信息。应用Northern杂交研究盐碱胁迫诱导14_3_3蛋白基因在盐碱胁迫后的表达，结果发现该基因的表达受盐碱胁迫诱导。将克隆的14-3-3蛋白基因构建植物表达载体PCAMBIA-1301-14-3-3，转化露地菊中，发现转基因菊花与对照相比具3有明显的抗盐碱能力，转基因露地菊可以在NaCl中能够正常生根、生长，而非转基因露地菊则出现生根抑制、生长缓慢现象，说明转基因露地菊具有明显的抗盐碱能力。附图说明图1为14-3-3蛋白基因PCR扩增电泳图，1 =DNA Marker DL2000 ；2 目的片段；图 2为盐胁迫后羊草中14-3-3基因的表达，样品顺序由1至7分别为200mmol/L Na2CO3浇灌处理他、211、611、1211、2411、4811、7211 ；图3为露地菊“火焰”转14_3_3基因及未转基因苗盐处理生根效果CK “火焰”为转化植株;2# 转基因株系2 ;5# 转基因株系5 ；A =NaCl浓度0 ； B =NaCl 浓度 IOOmmol/L ；C =NaCl 浓度 200mmol/L。具体实施例方式本专利技术技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。具体实施方式一本实施方式羊草盐碱胁迫诱导14-3-3蛋白基因的编码区序列如说明书附图中所示。具体实施方式二 本实施方式羊草盐碱胁迫诱导14-3-3蛋白基因的氨基酸序列如说明书附图中所示。具体实施方式三本实施方式羊草盐碱胁迫诱导14-3-3蛋白基因按以下步骤制备(一)羊草盐碱胁迫诱导14-3-3蛋白基因的克隆首先利用TSE法提取羊草的总RNA，用Amersham Biosciences公司的mRNA纯化试剂盒分离mRNA。采用PCR-klect cDNA Subtraction Kit，以盐碱胁迫下的羊草样品为试验方(Tester)，非盐碱条件下生长的羊草样品为消减方(Driver)构建羊草消减文库。然后对文库克隆进行测序，测序引物为T7引物，cDNA文库克隆的测序仪为GE公司的MegaBACE 1000DNA序列分析仪。通过对文库克隆的BlastX分析获得14_3_3蛋白基因片段，序列为GGCCAATCAGTGCCCCTCTCCCTCAGGCTTTGAGGCGGCTTCCTTGATCTCATCTCCGGCCCTCCTCTGTGTTATCGNGAGGTCCAGAGAGTCAAGTTGTCACGAAAAGTTGCATGATCAAGGTGCTGGGGCTTGTAGATTCCTCGCCGAGGGAGTACAGCTCAGCAATAGACTTCATCAAATGCCTGCTTGGCACAGGTTGCAAGCACGGTCTGGANGCAGTTCACCGGATTTCATAGGTAGAACCACCTGAGGAAGTTAGACGTGCCAACGTC根据获得的EST片段序列进行引物设计，利用RACE法，克隆获得羊草完整的 14-3-3基因。用NCBI ORF FOUNDER寻找开放读码框，所获得的基因cDNA序列全长1108bp， 编码区长786bp，编码262个氨基酸，结果见说明书附图。根据14-3-3基因的序列设计引物，利用RACE法进行PCR扩增，经0. 8%的琼脂糖凝胶电泳检测，在IlOSbp处得到了单一条带(见说明书附图1)，与预期结果一致。(二)羊草14-3-3基因对逆境胁迫的应答将温室(平均温度^°C，湿度约为60%，光照时间14h/d)中盆栽8周龄羊草分别用200mmol/L Na2CO3溶液浇灌，进行胁迫处理，分别在胁迫处理前，胁迫2，6，12，24，48，72h 后取羊草地上部分，迅速放入液氮冷冻，-80°C保存备用。TSE法提取不同胁迫条件下不同时间的羊草叶部总RNA，利用Northern杂交技术， 研究羊草中该基因在Na2CO3胁迫处理下不同时间点的表达情况，结果见说明书附图2。从图中可以看出，对照(非胁迫)羊草目的条带较弱，说明在非胁迫下羊草的 14-3-3基因表达量很低。而在盐胁迫后，14-3-3基因表达明显增加，且在1 和24h时出现高峰，表明该基因能够对Na2CO3胁迫做出应答。(三)外源14-3-3基因对露地菊耐盐性影响进一步将羊草14-3-3基因构建到植物表达载体pCAMBIA-1301中，利用农杆菌介导法将其转入到露地菊‘火焰’中，其中长势良好的1个转化株系经PCR和Southern检测， 表明14-3-3基因已整合到露地菊基因组中。将2个转基因露地菊株系和未转基因露地菊株系小芽接种在含有不同浓度NaCl 的MS培养基中，培养10天后观察发现，在NaCl浓度为0的培养基中未转化株系和2个转化株系本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李玉花，解莉楠，张旸，王江，
申请(专利权)人：李玉花，解莉楠，张旸，王江，
类型：发明
国别省市：