本发明专利技术属于植物基因工程技术领域，具体为一种荠菜冷诱导ＣｂＣＯＲ１５ａ基因及其在改良植物的抗寒性中的应用。该基因的核苷酸序列如ＳＥＱＩＤＮＯ：１所示，ＣｂＣＯＲ１５ａ基因是具有序列表ＳＥＱＩＤＮＯ：１中碱基第１－６７４位碱基的核酸序列，该核酸序列编码一个受零上低温诱导表达，在正常温度下停止表达或降低表达，表达后能促进细胞产生抗冷力的基因。利用该基因片段构建的诱导性表达载体可以在植物受到低温胁迫时表达。本发明专利技术还提供基于上述基因培育抗寒植物的应用方法，用于农作物品种的改良。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及一种荠菜冷诱导基因 CORl^a{CbCOR15a)及其制备方法，还涉及该基因的重组质粒，并将其应用于植物逆境基因 特别是用于植物抗寒基因的遗传转化，达到提高植物抗寒性的目的。
技术介绍
植物对环境变迁及不良环境有足够的适应性和抵抗能力，这种抗逆性既受系统进 化的遗传基因型控制，又受个体发育中的生理生态因素制约。温度作为重要的环境因子 之一，限制植物的分布及生长和产量，对植物生长发育起着决定性作用。低温寒害不仅是 农业生产中一种严重的自然灾害，亦是影响植物由南向北移动的一个非常重要的限制因 素。冷驯化是通过低温诱导植物形成抗冷力的过程。近年来的研究发现植物中的冷调节 蛋白(cold regulated proteins，CORPs)禾口冷马川化蛋白(cold acclimation proteins, CAIPs)是植物在冷驯化下产生的特异性蛋白质，他的最大特点在于其能够保护植物在低 温和干旱时避免受伤害，该蛋白可以避免细胞的过度失水对植物造成伤害(Mohapatra SS, ffolfraim L, Poole RJ, Dhindsa RS. Molecular cloning and relationship to freezing tolerance of cold-acclimation-specific genes of Alfalfa. Plant Physiol, 1988, 89:375-380; Gilmour SJ, Artus NN, Thomashow MF. cDNA sequence analysis and expression of two cold-regulated genes of Arabidopsis thaiiana. Plant Mol Biol 1992，18: 13-21)。由于冷调节蛋白的功能和特性的研究，使得人们通 过生物技术的手段培育抗寒植物成为可能。目前在植物中已发现了多种冷调节蛋白，但 不同植物之间及同一植物内部，不同的冷调节蛋白的氨基酸组成、序列、重复单元、重复次 数、空间结构、组织特异性分布等方面均表现出一定程度的差异性，它们的组成与结构也呈 现出多样性和复杂性。C0R15a基因是从拟南芥中分离出来的冷调节蛋白基因，是目前研 究最多的基因之一。C0R15a在低温诱导下表达后，可增加质膜的晶体稳定性，增加其原生(Anus NN, Uemura M, Steponkus PL, Gilmour SJ, Lin C, Thomashow MF. Constitutive expression of cold-regulated Arabidopsis thaliana C0R15a gene affects both c chloroplast and protoplast freezing tolerance. Proc Natl Acad Sci USA, 1996， 93:13404-13409)。荠菜、Capsella torsa-pastori s)是一种1或2年野生的草本植物，平铺地 面，喜阴，在南方是处处可见的一种可食用蔬菜，属于十字花科(Cruciferae)、荠菜属 (Capsella)，在低温条件下能够正常生长发育并结实。本专利技术所涉及的荠菜冷调节基因 {CbC0R15a)是从荠菜叶片的总RNA中克隆得到的。目前尚未发现有关荠菜冷调节基因 CbC0R15a的研究和利用该基因培育耐寒植物的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的第一目的就是提供一种新的冷诱导基因、CbCorl5a)，该基因是从荠菜 中克隆到的，是植物在冷驯化下产生的高表达的蛋白质。本专利技术的第二目的是提供一种新的冷诱导蛋白ij0bCorl5a)。本专利技术的第三目的是提供这种荠菜冷诱导蛋白多肽和编码序列在利用转基因技 术改良植物抗逆(耐低温)上的应用。在本专利技术的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，该分子包括编码具有荠 菜冷诱导蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID No. 1中从核苷酸 第1-674位DNA分子的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度 严紧条件下与SEQ ID No. 1中从核苷酸第1-674位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序 列编码具有SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID No. 1中从核苷酸第1-674位的核苷酸序列。在本专利技术的另一方面，提供了一种分离出的荠菜冷诱导蛋白质多肽，它包括具有 SEQ ID No. 2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肤、或其活性片段，或其活性衍生物。较 佳地，该多肽是具有SEQ ID No. 2序列的多肽。在本专利技术的另一方面，还提供了一种载体，它包含上述的DNA分子。在本专利技术的另一方面，还提供了一种用上述载体转化的宿主细胞。在实例中该宿 主细胞是酵母细胞、拟南芥、烟草和其它植物细胞。在本专利技术的另一方面，还提供了一种产生具有荠菜冷诱导蛋白质活性的多肽的方 法，其步骤如下(1)将编码具有荠菜冷诱导蛋白活性多肽的纯化的核苷酸序列可操作地连于表达调 控序列，形成荠菜冷诱导蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID No. 1中从核苷酸第 1-674位的核苷酸序列有至少70%的同源性；(2)将步骤(1)中的表达载体转入原核宿主细胞，形成荠菜冷诱导蛋白的重组细胞；(3)在适合表达荠菜冷诱导蛋白多肽的条件下，培养步骤(2)中的重组细胞；(4)分离出具有荠菜冷诱导蛋白活性的基本纯的多肽。较佳地，在该方法中使用的核酸序列具有SEQ ID No. 1中第1_674位的序列。在本专利技术的另一方面，还提供了一种利用转基因技术将编码具有荠菜冷诱导蛋白 活性多肽的核苷酸序列转化入植物以提高植物对干旱的耐受性的方法，其步骤如下(1)将编码具有荠菜冷诱导蛋白活性多肽的纯化的核苷酸序列可操作地连于植物表 达调控序列后，形成含荠菜冷诱导蛋白基因的植物表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID No. 1中从核苷酸第1-674位的核苷酸序列有至少70%的同源性；(2)将步骤(1)中的表达载体转入农杆菌，将含表达载体的农杆菌同真核宿主细胞共 培养，在22-28°C条件下，暗培养1-2天后，通过筛选如抗生素筛选，获得含有荠菜冷诱导 蛋白基因的转化细胞并最终再生转基因植株及其后代，包括植物种子及植物组织。含有荠 菜冷诱导蛋白基因的转基因植株对植物干旱耐受特性具有增强的作用。较佳地，在该方法中使用的核苷酸序列具有SEQ ID No. 1中第1_674位的序列。 本专利技术还提供了与荠菜冷诱导蛋白多肽特异性结合的抗体，它包括多克隆抗体和单克隆抗 体。在本专利技术中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段己从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA.或片段已经与天然状态下伴随核苷酸的组份 分开，而且己经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。在本专利技术中，术语“荠菜冷诱导蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有荠菜冷诱 导蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID No. 1中第1-674位核苷酸序列及其简并序 列。该简并本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离的具有低温诱导表达特性的荠菜冷诱导基因ＣｂＣＯＲ１５ａ，其特征在于，该基因的核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １中碱基第１－６７４位的序列所示。
【技术特征摘要】
一种分离的具有低温诱导表达特性的荠菜冷诱导基因CbCOR15a，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1中碱基第1 674位的序列所示。2.一种包含荠菜冷诱导基因伐OMVfe的重组质粒，其特征在于，它含有权利要求1所 述的核苷酸序列。3.一种荠菜冷诱导蛋白CbC0R15a，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。4.按照权利要求3所述的荠菜冷诱导蛋白CbCOR，其特征在于，所述的荠菜冷诱导蛋白 CbC0R15a由137个氨基酸构成的蛋白质。5.如权利要求1所述的荠菜冷诱导基因CbC0R15a的制备方法，其特征在于，包括以下 步骤(1)材料的培养，将荠菜种子经过消毒后，播种于含培养基的培养罐内；(2)提取冷驯化后的荠菜中RNA，经1%非变性琼脂糖凝胶电泳，用260-280nm波长的紫 外扫描来分析其质量；(3)采用RACE方法克隆得到荠菜冷诱导基因伐OMVfe的全长序列，RACE采用的引 物为 5’ CbC0R15al 5'-CTCTCCTGCTTTACCCTCCGCGAA-3'，5’ CbC0R15a2 5' -TTCTTTTCCT TTCTCCTCCACATA-3'。6.如权...
【专利技术属性】
技术研发人员：林娟，周明琦，沈忱，吴丽华，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：31[]
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