利用小球藻表达人干扰素基因的方法技术

本发明专利技术就是要提供一种利用小球藻表达人干扰素基因的方法，以小球藻为生物材料，包括HuIFN-α2b基因序列，用小球藻的偏好密码子对人干扰素HuIFN-α2b基因序列进优化改造，其所述方法包括：1）利用小球藻的使用频率高的偏好密码子取代小球藻的使用频率低的密码子，并转化大肠杆菌；2）用大肠杆菌转化子提取重组质粒pCAMBIA1304-IFN，并转入根癌农杆菌AGL-1；3） 利用根癌农杆菌介导的小球藻转化方法，将重组质粒pCAMBIA1304-IFN中的T-DNA区整合入小球藻的基因组DNA中并表达。用小球藻的偏好密码子对人干扰素（HuIFN-α2b）基因序列进行优化改造并人工合成该基因，利用根癌农杆菌AGL-1介导的方法成功转化蛋白核小球藻，获得稳定遗传的小球藻转化体，并检测到人工合成干扰素与绿色荧光蛋白融合基因在蛋白核小球藻转化细胞中成功表达。

【技术实现步骤摘要】

：本专利技术涉及生物工程
，特别是一种利用小球藻表达人干扰素基因的方法。技术背景：干扰素具有抗病毒、抗肿瘤以及免疫调节的功能，临床应用非常广泛，市场需求量巨大。目前，临床上应用的干扰素主要是原核表达系统生产的重组蛋白，但原核表达系统存在下游提取纯化工艺复杂、成本高等缺陷，寻找新的表达系统成为药用蛋白研究和生产的热点。小球藻特别是蛋白核小球藻作为一种营养丰富且繁殖快的真核单细胞藻类，是安全的新资源食品，作为药用蛋白表达系统有着天然的优势。利用农杆菌转化小球藻的研究是近年才出现的，2012年，Cha等[1]利用根癌农杆菌介导转化的方法将pCAMBIA1304质粒上的T-DNA区转入普通小球藻(C.vulgaris)，并且研究了预培养时间，共培养的时间、PH值、温度，以及乙酰丁香酮浓度和农杆菌OD值对转化的影响。2013年，马瑞娟等[2]利用根癌农杆菌介导转化的方法将pCAMBIA2301-idi的T-DNA区转入普通小球藻(C.vulgaris)，并成功获得转化子，且转化子叶黄素产量较野生型有明显提高。用于转基因植物筛选的选择基因通常是抗生素抗性基因和除草剂抗性基因。常用到的抗生素抗性基因有新霉素磷酸转移酶基因(NptⅡ基因)，潮霉素磷酸转移酶基因(HptⅡ基因)和氯霉素乙酰转移酶(CAT基因)等。陈颖、王逸云、cha等[3,4,1]人的试验说明不同的小球藻对抗生素的敏感性也不同，故如何来选择>一个小球藻较敏感的抗生素以及对应的选择基因是也是当前的一个重要课题。用于转基因植物基因表达检测的报告基因主要包括β-葡萄糖苷酶基因(GUS基因)、荧光素酶基因(Luc基因)、绿色荧光蛋白基因(GFP基因)以及冠瘿碱合成酶基因等。Cha等在转基因小球藻检测到了绿色荧光蛋白的表达。利用小球藻获得干扰素就必须得到转干扰素基因的小球藻，小球藻的遗传转化是获得转基因小球藻的途径。在众多遗传转化方法中，通过根癌农杆菌Ti质粒构建的外源基因转化体系是目前研究最多、机理最清楚、技术方法最成熟的基因转化方法，但是如何建立起一种稳定而高效的根癌农杆菌介导的小球藻遗传转化体系的关键所在。蛋白核小球藻的培养基为BG-11+10g/L葡萄糖，用100mg/L的潮霉素筛选转化体。为了提高外源基因在小球藻中的表达效率，优化并人工合成干扰素(HuIFN-α2b)基因，构建人工合成干扰素基因与绿色荧光蛋白融合表达的植物表达载体pCAMBIA1304-IFN，利用根癌农杆菌AGL-1介导的方法成功转化蛋白核小球藻，并获得稳定遗传的小球藻转化体。通过PCR和RT-PCR的验证，检测HuIFN-α2b基因转入蛋白核小球藻并在转录水平得到了表达；WesternBlot和荧光显微镜观察鉴定融合蛋白在蛋白核小球藻转化细胞内成功表达。
技术实现思路
：本专利技术就是要提供一种利用小球藻表达人干扰素基因的方法，用小球藻的偏好密码子对人干扰素(HuIFN-α2b)基因序列进行优化改造并人工合成该基因，构建人工合成干扰素基因与绿色荧光蛋白基因融合表达的植物表达载体pCAMBIA1304-IFN，利用根癌农杆菌AGL-1介导的方法成功转化蛋白核小球藻，获得稳定遗传的小球藻转化体，并检测到人工合成干扰素与绿色荧光蛋白融合基因在蛋白核小球藻转化细胞中成功表达。本专利技术一种利用小球藻表达人干扰素基因的方法，以小球藻为生物材料，包括HuIFN-α2b基因序列，用小球藻的偏好密码子对人干扰素HuIFN-α2b基因序列进优化改造，其所述方法包括：1)利用小球藻的使用频率高的偏好密码子取代小球藻的使用频率低的密码子，人工合成在小球藻中表达的人干扰素HuIFN-α2b基因序列，并连入pCAMBIA1304中，构建重组质粒pCAMBIA1304-IFN，并转化大肠杆菌；2)用大肠杆菌转化子提取重组质粒pCAMBIA1304-IFN，将所述重组质粒pCAMBIA1304-IFN转入根癌农杆菌AGL-1；3)利用根癌农杆菌介导的小球藻转化方法，将重组质粒pCAMBIA1304-IFN中的T-DNA区整合入小球藻的基因组DNA中，使优化改造的人干扰素HuIFN-α2b基因整合到小球藻基因组中并表达。本专利技术所述的一种利用小球藻表达人干扰素基因的方法，其所述1)步合成相应的小球藻表达的人干扰素HuIFN-α2b基因序列，方法如下：(1)用小球藻Rubisc蛋白对应氨基酸的密码子将小球藻使用频率低的密码子替换掉；(2)在优化的人干扰素HuIFN-α2b基因5′端加A，使其形成AflⅢ限制性酶切位点，在其3′去掉终止密码子，添加SpeⅠ的限制性酶切位点；(3)将pCAMBIA1304通过NcoⅠ(C|CATGG)和SpeⅠ(A|CTAGT)双酶切，人工合成人干扰素HuIFN-α2b基因用AflⅢ(A|CATGT)和SpeⅠ(A|CTAGT)双酶切，回收酶切片段，T4DNA连接酶将粘性末端连接，制成重组质粒pCAMBIA1304-IFN表达载体。本专利技术所述的一种利用小球藻表达人干扰素基因的方法，所述HuIFN-α2b基因序列的设计引物为：IFN-1FP：5′ATGTGCGACCTTCCCCAGAC3′IFN-1RP：5′CTCCTTAGACCTAAGGCTCTCC3′其扩增产物长度为498bp；IFN-2FP：5′ACAGGCACGACTTCGGCTTC3′IFN-2RP：5′CGCAAGGGCTGTACTTCTTCTC3′其扩增产物长度为321bp。本专利技术所述的方法，所述人干扰素HuIFN-α2b基因的合成按照优化后人干扰素HuIFN-α2b基因人工合成该序列，两端加AflⅢ和SpeⅠ酶切位点，将pCAMBIA1304通过NcoⅠ和SpeⅠ双酶切，人工合成序列构建AflⅢ和SpeⅠ双酶切，连接两个片段构建pCAMBIA1304-IFN表达载体。本专利技术所述小球藻优选为蛋白核小球藻。本专利技术是根据蛋白核小球藻对密码子的偏好性，设计并合成适合蛋白核小球藻表达的HuIFN-α2b基因序列，并连入pCAMBIA1304，构建的重组质粒命名为pCAMBIA1304-IFN，将其转化大肠杆菌，挑取若干大肠杆菌转化子提取重组质粒，经过PCR和酶切鉴定，确认重组质粒pCAMBIA1304-IFN构建成功。将pCAMBIA1304-IFN转入根癌农杆菌AGL-1，挑取若干农杆菌转化子进行PCR鉴定，确定其均为阳性转化子，可作为工程菌转化小球藻。利用根癌农杆菌介导的小本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用小球藻表达人干扰素基因的方法，以小球藻为生物材料，包括HuIFN‑α2b 基因序列，用小球藻的偏好密码子对人干扰素HuIFN‑α2b基因序列进优化改造，其特征是所述方法包括：1）利用小球藻的使用频率高的偏好密码子取代小球藻的使用频率低的密码子，人工合成在小球藻中表达的人干扰素HuIFN‑α2b基因序列，并连入pCAMBIA1304中，构建重组质粒pCAMBIA1304‑IFN，并转化大肠杆菌；2）用大肠杆菌转化子提取重组质粒pCAMBIA1304‑IFN，将所述重组质粒pCAMBIA1304‑IFN转入根癌农杆菌AGL‑1；3） 利用根癌农杆菌介导的小球藻转化方法，将重组质粒pCAMBIA1304‑IFN中的T‑DNA区整合入小球藻的基因组DNA中，使优化改造的人干扰素HuIFN‑α2b基因整合到小球藻基因组中并表达。

【技术特征摘要】
1.一种利用小球藻表达人干扰素基因的方法，以小球藻为生物材料，包括HuIFN-α2b基因序列，用小球藻的偏好密码子对人干扰素HuIFN-α2b基因序列进优化改造，其特征是所述方法包括：1）利用小球藻的使用频率高的偏好密码子取代小球藻的使用频率低的密码子，人工合成在小球藻中表达的人干扰素HuIFN-α2b基因序列，并连入pCAMBIA1304中，构建重组质粒pCAMBIA1304-IFN，并转化大肠杆菌；2）用大肠杆菌转化子提取重组质粒pCAMBIA1304-IFN，将所述重组质粒pCAMBIA1304-IFN转入根癌农杆菌AGL-1；3）利用根癌农杆菌介导的小球藻转化方法，将重组质粒pCAMBIA1304-IFN中的T-DNA区整合入小球藻的基因组DNA中，使优化改造的人干扰素HuIFN-α2b基因整合到小球藻基因组中并表达。
2.依据权利要求1所述的一种利用小球藻表达人干扰素基因的方法，其特征是所述1）步合成相应的小球藻表达的人干扰素HuIFN-α2b基因序列，方法如下：（1）用小球藻Rubisc蛋白对应氨基酸的密码子将小球藻使用频率低的密码子替换掉；（2）在优化的人干扰素HuIFN-α2b基因5′端加A，使其形成AflⅢ限制性酶切位点，在其3′去掉终止密码子，添加SpeⅠ的限制性酶切位点；（3）将pCAMBIA1304通过NcoⅠ（C|CATGG）和SpeⅠ(A|CTA...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢其能，周琨，徐长豪，李润根，
申请(专利权)人：宜春学院，
类型：发明
国别省市：江西;36