本发明专利技术涉及“鸡-γ-干扰素基因序列，其重组工程菌及应用”，属于生物技术领域。本发明专利技术对采用人工合成的序列如SEQ?ID?NO1或SEQ?ID?NO2，以酿酒酵母作为宿主菌株，得到了重组工程菌，经PCR、酶切、测序、SDS-PAGE、ELISA和CPE检测结果表明：ChIFN-α和ChIFN-γ基因均能在宿主菌株中胞内表达，并表达蛋白具有明显的生物学活性。实验表明，本发明专利技术将酿酒酵母作为生物反应器生产鸡干扰素药用蛋白，不仅可以极大降低干扰素生产成本，而且可以在提供优质蛋白的同时达到改善机体免疫功能的目的，为利用酵母添加剂防治动物疫病奠定基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物程领域，特别是涉及人工合成的鸡干扰素基因序列，一种以酿酒酵母作为受体菌而得到的重组工程菌，其能进行胞内表达生产动物干扰素。
技术介绍
酿酒酵母(S a cch a romyces cerevisiae)是一种良好的营养与保健饲料添加剂， 其营养丰富，富含B族维生素、矿物质、消化酶、促生长因子和较齐全的氨基酸。使用酵母添加剂可以提高饲料蛋白含量，刺激有益菌生长，提高机体免疫力，促进营养物质消化吸收和动物生长发育。同时，酿酒酵母也是最早用于基因工程的酵母菌株，是真核生物生物学研究的模式生物，其表达蛋白能有效保持生物学活性，利用酿酒酵母表达系统，人类已经获得一些重要药用蛋白。鸡α干扰素(ChIFN-α)和鸡、干扰素(ChIFN-Y )具有高效广谱的抗病毒、免疫调节、抗肿瘤细胞增殖、提高抗逆性和促进生长等多种重要生理功用，是养禽业用来防治鸡新城疫、传染性支气管炎、传染性喉气管炎、传染性法氏囊、减蛋综合征等多种鸡病毒性传染病的重要药物。尽管干扰素的临床价值极高，但是目前因生产的高昂成本却制约着其在畜牧业中的广泛应用。
技术实现思路
针对上述领域中的缺陷，本专利技术提供一种人工合成的鸡干扰素基因序列，并提供以酿酒酵母作为受体菌而得到的重组工程菌，利用酿酒酵母作为受体菌胞内表达鸡干扰素，酵母发酵产量大，产物不需分离纯化，直接饲喂含有鸡干扰素的酵母饲料重组菌株，可以实现畜牧业中干扰素的低成本供给问题，在提供鸡体营养物质的同时达到提高其免疫力的目的，避免了疫苗注射等繁琐管理和饲喂抗生素等药物带来的畜产品药物残留问题。一种人工合成的鸡干扰素基因YEChlFNR，其核苷酸序列如SEQ ID NOl所示。一种人工合成的鸡干扰素基因YEChlFNG，其核苷酸序列如SEQ ID N02所示。一种重组表达载体，具有上述人工合成的鸡干扰素基因YEChlFNR，或YEChlFNG， 其骨架载体为PYES2/CT。一种重组工程菌，具有上述人工合成的鸡干扰素基因YEChlFNR，或YEChlFNG，所述受体菌为酿酒酵母菌株INVScl。上述重组工程菌生产药用蛋白鸡干扰素的方法，包括如下步骤(I)、酵母菌的培养保种的重组工程菌接种于SC选择培养基上，于30°C，200r/ min过夜震荡培养；(2)、酵母菌的诱导表达培养当过夜培养的新鲜菌液0D600=0. 3-0. 5时，离心收集菌体并用含半乳糖的液体诱导培养基重悬，并于30°C、200r/min振荡培养。所述诱导培养的条件为诱导12h，重组菌液发酵pH值为3. 8-4. 0,2. 5%的半乳糖浓度。所述步骤还包括保种的重组工程菌的制备方法，将重组工程菌在YPD筛选培养基培养，菌落PCR筛选，挑取阳性克隆单菌落，SC选择培养基，30°C振荡过夜培养保种。所述步骤还包括菌体细胞的裂解，所述步骤(2)的酵母菌培养到对数生长期时，取出转速1500rpm/min离心5min收集菌体,灭菌水重悬菌体细胞之后，10000r/min离心30s, 得菌体细胞用裂解缓冲液重悬。所述菌体细胞裂解前液氮冷冻后置_80°C保存备用，裂解缓冲液重悬的 0D_=50_100。所述SC选择培养基为0. 8%Ura缺陷培养基粉+2%葡萄糖；所述YPD筛选培养基为2%胰蛋白胨+1%酵母提取物，2%葡萄糖+60mg/l Amp (氨节青霉素)；所述诱导培养基为O. 8%Ura (尿嘧啶)缺陷培养基粉+2%半乳糖+1%棉子糖或者2%葡萄糖。本研究通过构建鸡干扰素基因ChIFN的酿酒酵母表达载体，并通过电击法将其转化酵母菌株INVScl，对重组菌株的pH值、诱导时间和诱导剂浓度等诱导条件进行优化，并对重组蛋白及其生物学活性进行进检测和分析，证明功能基因已在受体菌中获得正确翻译表达，重组ChIFN-α和ChIFN-Y蛋白具有抗病毒活性，为开发具有抗病功能的饲料微生物添加剂奠定了基础。本研究对探索禽流感等病毒性疾病的防治新途径和保证家禽的安全生广具有积极的意义。本专利技术通过酿酒酵母生物反应器表达生产动物药用蛋白，极大地降低生产成本， 在给动物提供优质蛋白的同时提高机体免疫力。本专利技术的总体的技术方案包括下列步骤Α、表达载体构建对目的基因进行核苷酸密码子偏好性改造，利用基因直接合成方法，获得待表达蛋白质编码基因片段，将得到的基因片段克隆到表达质粒中，鉴定后通过电击法转入酿酒酵母菌株。B、表达质粒及重组菌株鉴定分别利用PCR、酶切、测序和表型诱导筛选，进行构建质粒和重组菌株的筛选鉴定。C、重组蛋白检测使用SDS-PAGE和ELISA检测重组蛋白及其表达量。D、酵母菌的培养保种的基因工程酵母菌株接种于SC选择培养基上，于30°C倒置培养至单菌落长出后，挑取活化后的单菌落于YPD酵母菌完全液体培养基中过夜培养。E、酵母菌的诱导表达培养当过夜培养的新鲜菌液0D_=0.4时，1500*g离心 5min，收集菌体并用同样体积的含半乳糖诱导剂的液体诱导培养基重悬，并于30°C、200r/ min振荡培养。F、诱导时间确定新鲜菌液在添加诱导剂后的不同时间点分别测定重组蛋白数量，确定半乳糖添加量。G、发酵pH值的确定新鲜菌液在添加诱导剂后的不同时间点分别测定菌液的pH 值，并检测重组蛋白数量，确定重组酵母发酵的最适pH。H、诱导剂添加量的优化新鲜菌液在添加诱导剂后的不同时间点分别测定重组蛋白数量，确定半乳糖添加量。I、重组蛋白活性检测使用CPE试验和利用IBDV-CEF系统检测重组鸡干扰素的抗病毒活性。本专利技术通过电击法将经过改造的鸡干扰素编码基因ChIFN-α和ChIFN-Y导入饲料酿酒酵母菌株中，使其能够作为生物反应器生产药用蛋白鸡干扰素。专利技术人利用INVScl 酿酒酵母菌株作为受体菌，经基因工程改造后得到鸡干扰素重组基因工程菌株，经PCR、酶切鉴定、测序、SDS-PAGE、ELISA和CPE检测，结果表明=ChIFN-α和ChIFN-Y基因整合到受体菌染色体基因组中，并得到正确的翻译表达，重组菌株成功表达具有生物学活性的ChIFN 蛋白。酵母微生物发酵容易，产量大，自身具有营养和保健价值，与现有生产技术相比较，本专利技术将酿酒酵母作为生物反应器生产鸡干扰素药用蛋白，不仅可以极大降低干扰素生产成本，而且可以在提供优质蛋白的同时达到改善机体免疫功能的目的。附图说明图I为酵母表达载体pYE-IFNR的物理图谱，利用氨苄青霉素(Amp)基因和URA3 (尿嘧啶合成酶)营养缺陷标记基因和作为筛选和标记基因。图2酵母表达载体pYE-IFNG的物理图谱，利用氨苄青霉素(Amp)基因和URA3 (尿嘧啶合成酶)营养缺陷标记基因和作为筛选和标记基因。图3为YEChIFNR基因的菌落PCR检测，PCR扩增获得的条带大小为582，与目标片段大小一致。其中M为DL2000DNA marker, 1-5为不同Amp抗性菌株。图4为重组质粒pYE-IFNR酶切鉴定，使用Xho I /Kpn I双酶切pYE_IFNR质粒后， 得到的片段与目标片段大小一致。其中M为DNAmarker，1-8为不同样品。图5为YEChIFNG基因的菌落PCR检测，PCR扩增获得的条带大小为459，与目标片段大小一致。其中M1和M2为DNA marker, 1-16为不同Amp抗性菌株本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人工合成的鸡干扰素基因YEChIFNG，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO2所示。
【技术特征摘要】
1.ー种人工合成的鸡干扰素基因YEChlFNG，其核苷酸序列如SEQ ID N02所示。2.—种重组表达载体，具有权利要求I所述的人工合成的鸡干扰素基因YEChlFNG，其骨架载体为PYES2/CT。3.—种重组工程菌，具有权利要求I所述的人工合成的鸡干扰素基因YEChlFNG，所述受体菌为酿酒酵母菌株INVScl。4.权利要求3所述的重组工程菌生产药用蛋白鸡干扰素的方法，包括如下步骤 (1)、酵母菌的培养保种的重组工程菌接种于SC选择培养基上，于30°C，200r/min过夜震荡培养； (2)、酵母菌的诱导表达培养当过夜培养的新鲜菌液OD6tltl=O.3-0. 5时，离心收集菌体并用含半乳糖的液体诱导培养基重悬，并于30°C、200r/min振荡培养。5.根据权利要求4所述的方法，所述步骤(2)的培养条件为诱导1...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵德刚，李义，宋莉，卢凌霄，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：
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