一种唐古特白刺NtCIPK9基因及其表达蛋白和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种唐古特白刺NtCIPK9基因及其表达蛋白和应用，所述NtCIPK9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术根据唐古特白刺的抗逆特性，利用唐古特白刺的叶片组织，在已有的部分转录组数据的基础上，同源克隆了唐古特白刺抗逆相关的CIPK基因全长，依据拟南芥中的同源基因而命名为NtCIPK9。通过NtCIPK9基因纯合拟南芥植株的耐盐性分析，证明了唐古特白刺NtCIPK9基因在植物耐盐方面的功能，为植物抗逆基因库增加资源。

【技术实现步骤摘要】
一种唐古特白刺NtCIPK9基因及其表达蛋白和应用
本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及一种唐古特白刺NtCIPK9基因及其表达蛋白和应用。
技术介绍
唐古特白刺（Nitrariatangutorum）属于蒺藜科（Zygophyllaceae）白刺属（Nitraria），强旱生落叶灌木，为中国特有白刺种类，主要分布于我国西北部地区。唐古特白刺抗旱、耐盐碱、防风沙、耐贫瘠，可改善盐碱质土壤，提高土壤肥力，防风固沙，维持绿洲，保护生态平衡。其浆果状核果富含维生素C、黄酮、蛋白质、以及19种氨基酸和21种微量元素，具有食用价值。此外，其果实还具有健脾胃，降血脂，降血糖以及抗氧化等药用价值。唐古特白刺作为一种生态和经济植物逐渐受到关注。目前，对唐古特白刺的研究主要集中在抗旱耐盐生理生化性质，果实营养成分分析以及育种等方面，为唐古特白刺的分子机理研究提供大量的数据支持，为抗性基因及其它功能基因的运用奠定基础。CIPKs（CBL-interactingproteinkinase），Ca2+信号途径中与上游CBL特异性相互作用的蛋白激酶，这类蛋白在N端含有保守的SNF激酶结构域和C端的NAF结构域。在模式植物拟南芥中有26个CIPK类同源异型盒基因，水稻中有30个CIPK类同源异型盒基因，杨树中有27个CIPK类同源异型基因。另外，到目前为止，还没有在植物以外的物种中发现类似基因，因此CIPK基因是植物所特有的Ca2+信号通路中的Ser/Thr类磷酸蛋白激酶基因。众多研究表明，植物所特有的CIPK类基因在植物耐盐，耐低钾，抗寒和抗旱等抗逆过程中发挥重要作用。在拟南芥的研究中发现，AtCIPK9基因是植物响应低钾环境的一个关键调控基因。在拟南芥突变体cipk9-1和cipk9-2植株与野生型相比，其生长明显受到低钾环境的抑制。CIPK9基因启动子的GUS染色和荧光实时定量PCR分析表明，CIPK9基因在拟南芥的根茎叶中均有表达。根部的表达主要是在根部的成熟区，包括根毛，在根尖和伸长区并无CIPK9基因的表达。此外，在拟南芥的花瓣，萼片和荚果中也能检测到CIPK9基因的表达。分子生物学研究证明了CIPK9与CBL3共同作用，调节植物体内钾离子平衡。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术中存在的不足，本专利技术的目的是提供一种唐古特白刺NtCIPK9基因。本专利技术的另一目的是提供唐古特白刺NtCIPK9基因的表达蛋白。本专利技术还有一目的是提供唐古特白刺NtCIPK9基因在植物耐盐育种中的应用。技术方案：为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种唐古特白刺NtCIPK9基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。上述的唐古特白刺NtCIPK9基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。上述的唐古特白刺NtCIPK9基因在植物耐盐育种中的应用。含有唐古特白刺NtCIPK9基因的载体。含有唐古特白刺NtCIPK9基因的宿主细胞。有益效果：与现有技术相比，本专利技术根据唐古特白刺的抗逆特性，利用唐古特白刺的叶片组织，在已有的部分转录组数据的基础上，同源克隆了唐古特白刺抗逆相关的CIPK基因全长，依据拟南芥中的同源基因而命名为NtCIPK9。在正常培养环境中，唐古特白刺NtCIPK9基因过表达的拟南芥T3代纯合植株的生长发育与野生型无明显差异。在盐胁迫处理过程中，转NtCIPK9基因纯合株的耐盐性大于野生型拟南芥。通过NtCIPK9基因纯合拟南芥植株的耐盐性分析，证明了唐古特白刺NtCIPK9基因在植物耐盐方面的功能，为植物抗逆基因库增加资源，这对于提高植物的耐盐性研究具有重要意义。附图说明图1是唐古特白刺总RNA的1%琼脂糖凝胶电泳图；图2是NtCIPK9基因片段克隆，5’RACE，3’RACE以及NtCIPK9基因全长克隆的PCR结果；图3是NtCIPK9基因的表达载体图；图4是T1代拟南芥植株筛选结果；图5是转基因拟南芥种子子叶萌发率统计图；图6是拟南芥种子在含盐培养基上萌发后两周的生长状态图；图7是转基因拟南芥盐处理10天后生长表型图；图8是转基因拟南芥盐处理10天后叶片及侧根数量统计结果图；图9是转基因拟南芥盐处理10天后主根长度统计结果图；图10是转基因拟南芥盐处理10天后植株整体干重统计结果图；图11是盐溶液处理转基因拟南芥表型图；图12是200mM盐水处理转基因拟南芥4天后的拟南芥表型图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的说明。实施例1以唐古特白刺的叶片为材料，提取总RNA，并反转成cDNA，设计相应引物进行PCR，琼脂糖凝胶电泳后，回收目的条带，与pMD19-T载体连接，转入大肠杆菌，测序并分析。确定为目的序列后，依据该序列设计RACE引物，PCR获取5’和3’序列，测序分析后，拼接得到NtCIPK9全长序列。依据全长序列设计引物，PCR获得全长片段，与pMD19-T载体连接，转入大肠杆菌，再次测序和分析，确定为全长片段后，挑取阳性克隆进行质粒抽提，加入酶切位点后与载体pBI121同时双酶切，在T4连接酶的作用下连接后，转入农杆菌EHA105和GV3101中，待拟南芥适龄后，通过花器官浸泡转化法进行转化，获取T1代和T2代种子，筛选到纯合T3代后，进行盐处理，表型观察和耐盐性分析。具体如下：（1）总RNA的提取以唐古特白刺的叶片为材料，按照NORGEN试剂盒（NorgenBiotek）的操作步骤进行RNA的提取，所使用的试剂和耗材均处理使其无RNA酶。唐古特白刺叶片总RNA的1%琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，条带清晰；测定总RNA的吸光度，OD260/OD280值为2.01，OD260/OD230为1.98，可见RNA质量较好。RNA提取的具体过程为：加入800μLLysisSolution磨样。匀浆后将裂解液转移至新管中。混匀2min使其彻底裂解，12000rpm离心2min，上清移至新管中。加入等体积的70%乙醇，涡旋混匀。将混合液移至柱子中（下接2ml收集管），离心1min，倒掉滤液，放回收集管。加入400μLWashSolution，离心1min，弃滤液，放回收集管。加入DNAI工作液，12000rpm离心1min，将滤液吸回柱子上，25-30℃静置15min。加入400μLWashSolution，12000rpm离心1min，弃滤液。第三次加入400μLWashSolution，12000rpm离心1min，弃滤液。将柱子放回收集管，12000rpm离心2min，弃收集管。将柱子放入1.7ml管子中加入50μLElutionSolution。200~2000rpm离心2min，12000rpm离心1min，体积不足50μL，再用14000rpm离心1min。（2）cDNA的获得以所提RNA为模板，反转录获得cDNA，所使用的是Invitrogen公司的SuperScript®IIIFirst-StrandSynthesisKit。实验中的RNA使用量为1μg，具体过程为：配置反应液（1μLRNA（≤5μg），1μLPrimer（OligodT），1μL10mMdNTPmix，DEPC-TreatedWater，upto10μL），短暂低速离心后，65℃5min，立即本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种唐古特白刺NtCIPK9基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种唐古特白刺NtCIPK9基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.权利要求1所述的唐古特白刺NtCIPK9基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3.权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：成铁龙，鲁路，陈金慧，施季森，周艳威，郑晨，盛宇，史胜青，杨秀艳，李霞，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32