蜂蜜基因的提取方法，涉及生物化学领域。本发明专利技术方法采用了10毫升以上的蜂蜜进行提取，又采用磷酸盐缓冲溶液去除蜂蜜中的可溶性多糖，利用裂解缓冲液使蜂蜜中的植物成分细胞裂解，同时用高浓度的氯化钠溶液除去大部分糖蛋白，减少纯化时糖蛋白对DNA的干扰。用苯酚、氯仿、异戊醇混合溶液进一步除去蛋白，最后用异丙醇在低温条件下使DNA沉淀，获得纯化的蜂蜜DNA。本发明专利技术方法结果稳定，重现性好，且操作简单、费用低、无需特殊仪器和试剂，所得蜂蜜DNA质量较好，能满足聚合酶链式反应的要求，可实现蜂蜜品质的快速鉴定。本发明专利技术方法可开发蜂蜜基因提取试剂盒，提取获得的蜂蜜DNA可作为试剂应用于蜂蜜来源的快速鉴定中。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物化学领域，具体涉及。
技术介绍
蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物结合后，经充分酿造而成的天然甜物质。蜂蜜中含有多种糖，主要是果糖和葡萄糖。此外，还含有有机酸、酶和固体颗粒物如植物花粉等。由于蜂蜜市价较高，市场需求量大，有一些不法商贩以假乱真、以次充好，严重地损害了消费者利益，因此急需建立蜂蜜产品的鉴别评价体系。虽然蜂蜜产品从外观、口感等方面难以区分，但是蜂蜜DNA与蜜源植物有关，这是无法伪造的， 因此，基因检测手段在蜂蜜的质量控制方面显得尤为重要。目前国内外常用的种属成分检测方法，主要是以核酸为基础的聚合酶链式反应检测方法，简称PCR法。PCR法一般要求模板DNA的浓度达到20 ng/μ 1以上，纯度采用0D26(1/0D28(1比值来表示，0D26(1/0D28(1 比值需在1. Tl. 0之间。由于蜂蜜所含成分复杂，DNA较难提取，这在一定程度上限制了蜂蜜PCR检测方法的开展。目前常用的DNA提取方法主要有高盐低pH法、苯酚法和CTAB法。其中高盐低pH法主要用于植物组织DNA的提取。低pH有利于防止植物中的多酚类物质氧化，高盐则是有利于蛋白质沉淀。本实验尝试将高盐低PH法应用于蜂蜜DNA的提取中，经测定，采用高盐低PH法提取的洋槐蜂蜜DNA的浓度与纯度较低，DNA的浓度为 13ng/y l,OD260/OD280为1. 25，难以满足PCR反应的要求。经分析，高盐低pH法不适用于蜂蜜DNA提取的主要原因是与一般植物组织相比，蜂蜜样品中的DNA含量较少，采用高盐低pH 法难以达到富集纯化蜂蜜DNA的目的。苯酚法是采用裂解液将DNA释放出来，然后交替用苯酚、氯仿这两种不同的蛋白质变性剂进行抽提，去除溶液中的蛋白质。苯酚、氯仿去蛋白质的能力较强而去多糖的能力较弱，适用于动物组织DNA的提取。本实验尝试将苯酚法应用于蜂蜜DNA提取中，样品经过苯酚及氯仿溶液的多次抽提后，所获得的DNA的质量较低，DNA的浓度为llng/μ 1，OD260/ OD28tl为1.43，难以满足PCR反应的要求。苯酚法不适用于蜂蜜DNA提取的主要原因是蜂蜜样品中的DNA含量低，在苯酚及氯仿溶液的多次抽提反应中损失较大，导致最终获得的DNA 含量偏低，DNA质量达不到下一步PCR检测的要求。CTAB法因为能较好地去除多糖杂质，故常用于植物组织DNA的提取。CTAB,即十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂。CTAB既可以裂解细胞膜，使核酸释放出来，又可在不同的盐离子浓度下选择性地沉淀多糖或者核酸，从而达到纯化DNA的目的。本方法尝试将常规CTAB法直接应用于蜂蜜DNA的提取中，所得蜂蜜DNA的浓度为16ng/y 1，OD260/ OD280为1. 39，不能满足后续PCR检测的需求。常规CTAB法不适用于蜂蜜DNA提取的主要原因是蜂蜜成分复杂，特别是多糖及蛋白含量高，应用常规CTAB法无法有效去除多糖以及蛋白杂质，影响了蜂蜜DNA的得率以及纯度。由于蜂蜜成分复杂，其中大约75%的成分为糖类，同时还含有多种酶、氨基酸、无机盐等，常规的CTAB法也无法提取获得高浓度与高纯度的蜂蜜DNA。所以必须改进，寻找能提取高浓度与高纯度蜂蜜DNA的方法，以满足PCR检测的要求。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种从蜂蜜中提取基因的方法。 本专利技术的技术方案采用，按以下步骤顺序进行(1)取10mL以上蜂蜜，加入等体积的PH为7. (Γ8. 0的磷酸盐缓冲溶液，振荡广3小时，充分混勻后离心，弃去上清液，加入3 mL pH为7.CT8.0的磷酸盐缓冲溶液溶解沉淀，离心，弃去上清液，保留沉淀物；(2)加入1mL裂解缓冲液于沉淀物中，充分悬浮，混勻，加入10 4 1^农度为201^/1^的蛋白酶K溶液，混勻，置65 ！水浴加热45飞0 min，不时摇动；所述的裂解缓冲液是十六烷基三甲基溴化铵、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸和氯化钠的混合水溶液，其中十六烷基三甲基溴化铵的浓度为50mmol/L，三羟甲基氨基甲烷的浓度为lOmmol/L，乙二胺四乙酸的浓度为2mmol/L，氯化钠的浓度为400mmol/L，用盐酸调pH至8. 0 ；(3)取出，加入300μ 1饱和氯化钠溶液，剧烈振荡2分钟，置于0 °C下放置3、min, 离心；(4)取上清液，加入等体积的苯酚氯仿异戊醇体积比为25:24:1的混合溶液，混勻， 离心；(5)取上清液，加入等体积的氯仿异戊醇体积比为24:1的混合溶液，混勻，离心；(6)取上清液，加入十分之一体积的3mol/L醋酸钠溶液，混勻，加入与混合液等体积的异丙醇，混勻，在-20 °C放置2小时，离心，弃去上清液，保留沉淀物；(7)取沉淀物用75、0%乙醇洗涤后，室温下将乙醇吹干，将沉淀在室温下干燥得蜂蜜 DNA干品或将沉淀溶于pH8. 0的TE溶液中，即得蜂蜜DNA试剂。TE溶液中三羟甲基氨基甲烷的浓度为lOmmol/L，乙二胺四乙酸的浓度为lmmol/L，其余为水。本专利技术方法中，各步骤所述的离心操作为本领域分离DNA的常规操作，离心速度和时间通常为12 000 rpm离心10 min，并尽量在低温下操作。本专利技术方法中，所述的蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物结合后，经充分酿造而成的天然甜物质，如洋槐蜂蜜、荔枝蜂蜜等；本专利技术方法采用了 10 mL以上的蜂蜜提取体系，通过增大样品量的方法提高所获得蜂蜜DNA的浓度，又采用磷酸盐缓冲溶液去除蜂蜜中的可溶性多糖，利用裂解缓冲液使蜂蜜中的植物成分细胞裂解，在裂解细胞的同时用高浓度的氯化钠溶液使蛋白沉淀，并利用 CTAB在高离子强度下能使多糖沉淀但不能使核酸沉淀的原理，有效降低了糖蛋白对DNA纯化的干扰。用苯酚、氯仿、异戊醇混合溶液进一步除去蛋白，最后用异丙醇在低温条件下使核酸沉淀，获得片段完整，高浓度高纯度的蜂蜜DNA。所得蜂蜜DNA可满足PCR反应的要求， 使得利用分子生物学手段鉴定蜂蜜品质得以实现。本专利技术方法结果稳定，重现性好，操作简便，无需特殊仪器和试剂。经测定，本专利技术方法提取的蜂蜜DNA的浓度在lOOng/μ 1以上，0D26(1/0D28(1的比值在1. 7 2. 0之间，具体数据参见实施例中表1。本专利技术采用PCR扩增反应以及DNA琼脂糖凝胶电泳等方法对不同方法提取获得的蜂蜜DNA质量进行了检测。检测结果表明，本专利技术方法提取的蜂蜜DNA质量较好，进行PCR反应时可获得目标PCR产物，本专利技术可广泛应用于蜂蜜的分子生物学检测领域。本专利技术针对蜂蜜样品的特殊性，开发了高效的蜂蜜DNA提取方法，成功地从多种类型的蜂蜜样品中提取获得了高质量的蜂蜜DNA。在本方法的基础上可进一步根据蜂蜜蜜源植物品种设计特异性、专一性的引物序列进行PCR反应扩增，根据检测结果快速鉴定所提取蜂蜜样品的植物来源。如蜂蜜外包装标识的是金银花蜂蜜，通过本专利技术提取蜂蜜样品 DNA并进行PCR检测，如获得的蜂蜜DNA达到PCR检测要求，而不能扩增检测出金银花特异基因序列，则说明该蜂蜜并不是来源于金银花。本专利技术方法可开发特异性的蜂蜜基因提取试剂盒，所提取的蜂蜜DNA是应用于后续PCR检测中的关键试剂，使得应用分子生物学手段来鉴定蜂蜜的植物来源成为可能。本专利技术建立了稳定本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：柯振华，罗海英，吴玉銮，冼燕萍，郭新东，陈意光，罗东辉，
申请(专利权)人：广州市质量监督检测研究院，
类型：发明
国别省市：
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