猪链球菌胞壁水解酶、其编码基因及应用制造技术

本发明专利技术提供猪链球菌胞壁水解酶、其编码基因及应用，涉及生物技术领域。猪链球菌胞壁水解酶，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。本发明专利技术还公开了猪链球菌胞壁水解酶的编码基因及含有猪链球菌胞壁水解酶的基因的重组表达载体和重组菌。提供了制备猪链球菌胞壁水解酶的方法，通过培养所述重组菌并进行纯化后得到所述猪链球菌胞壁水解酶。本发明专利技术猪链球菌胞壁水解酶，能够有效杀灭猪链球菌，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及嗜水气单胞杆菌。猪链球菌胞壁水解酶的基因可以在重组大肠杆菌中高效表达，所得猪链球菌胞壁水解酶活性和稳定性高，能够有效杀灭猪链球菌，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及嗜水气单胞杆菌。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体涉及一种猪链球菌胞壁水解酶、其编码基因和应用。技术背景猪链球菌是一种重要的人兽共患病病原，可以引起脑膜炎、关节炎、心内膜炎、败血症、肺炎、休克和突然死亡等。该菌按荚膜多糖抗原差异可分为33个血清型，其中2型(SS2)是流行最广，致病性最强，猪群携带率较高的病原，给养猪业造成巨大经济损失，对公共卫生尤其是从业人员的生命安全亦构成严重威胁。荷兰、英国、美国、加拿大、澳大利亚、新西兰、比利时、巴西、丹麦、挪威、芬兰、西班牙、德国、爱尔兰、日本、中国台湾及大陆等先后报道了该病。猪链球菌病2型感染后一般采取抗生素治疗，但近年来抗生素的滥用，使猪链球菌2型产生了严重的耐药性，给该病的防控带来困难。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种猪链球菌胞壁水解酶，能够有效杀灭猪链球菌。本专利技术的另一目的是提供猪链球菌胞壁水解酶的基因。本专利技术的再一目的是提供猪链球菌胞壁水解酶在杀灭猪链球菌方面的应用。本专利技术的目的采用如下技术方案实现:一种猪链球菌胞壁水解酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。编码所述猪链球菌胞壁水解酶的基因。所述基因的序列如SEQ ID NO:2所示。可以理解的是，由于氨基酸密码子的简并性，本专利技术中编码猪链球菌胞壁水解酶的基因除了SEQ ID N0.2所示的序列，还包括编码上述氨基酸序列的其他核酸分子。含有猪链球菌胞壁水解酶的基因的重组表达载体。所述猪链球菌胞壁水解酶的基因序列可以为SEQ ID N0.2所示。所述重组表达载体是将猪链球菌胞壁水解酶的基因插入pET-32a (+)的EcoR I和Xho I酶切位点之间。含有猪链球菌胞壁水解酶的基因的重组菌。所述猪链球菌胞壁水解酶的基因序列可以为SEQ ID N0.2所示。一种制备猪链球菌胞壁水解酶的方法，通过培养所述重组菌并进行纯化后得到所述猪链球菌胞壁水解酶。所述猪链球菌胞 壁水解酶在杀灭猪链球菌方面的应用。本专利技术的有益效果:本专利技术提供的猪链球菌胞壁水解酶，能够有效杀灭猪链球菌，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及嗜水气单胞杆菌。本专利技术猪链球菌胞壁水解酶的基因可以在重组大肠杆菌中高效表达，所得猪链球菌胞壁水解酶活性和稳定性高，能够有效杀灭猪链球菌，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及嗜水气单胞杆菌。采用本专利技术重组菌进行制备猪链球菌胞壁水解酶，方法简单，成本低廉。附图说明图1为重组表达蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中:1、对照菌的菌体裂解液；2、无IPTG诱导培养的BL21-pET32a-LytA的菌体裂解液；3_6、IPTG诱导培养的BL21-pET32a-LytA的菌体裂解液，诱导时间分别为2h、3h、4h和5h ;7、纯化后的重组表达蛋白；M、蛋白分子marker。图2为验证重组表达蛋白胞壁水解酶活性的酶谱实验图,其中:1、纯化的重组表达蛋白；2、对照菌裂解液；M、蛋白分子marker。图3为重组表达蛋白的Western-blotting分析电泳图,其中:1、对照菌的菌体裂解液；2、纯化后的重组表达蛋白；M、蛋白分子marker。图4是重组表达蛋白对猪链球菌2型HA9801株的平板溶菌试验照片，其中纸片I上滴加的是纯化的重组表达蛋白，纸片2上滴加的是经IPTG诱导培养的含空载体pET32a的BL21裂解液，纸片3上滴加的是PBS缓冲液。图5是重组表达蛋白对猪链球菌2型ZY05719株的平板溶菌试验照片，其中纸片I上滴加的是纯化的重组表达蛋白，纸片2上滴加的是经IPTG诱导培养的含空载体pET32a的BL21裂解液，纸片3上滴加的是PBS缓冲液。图6是重组表达蛋白对猪链球菌2型T15株的平板溶菌试验照片，其中纸片I上滴加的是纯化的重组表达蛋白，纸片2上滴加的是经IPTG诱导培养的含空载体pET32a的BL21裂解液，纸片3上滴加的是PBS缓冲液。 具体实施例方式下面对本专利技术的实施例作详细说明，本实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，未注明具体条件的实验方法、工作原理，通常按照常规条件进行。本专利技术的保护范围不先于下述的实施例。猪链球菌2型T15株的公开信息:Vecht，U.，J.P.Arends, etal.(1989).Differences in virulence between two strains of Streptococcus suistype II after experimentally induced infection of newborn germ-free pigs.Am JVet Res50(7):1037-1043。实施例1猪链球菌胞壁水解酶、其编码基因的获得通过酶谱试验分析了猪链球菌2型T15株的胞壁水解酶，发现该菌株中存在一种猪链球菌胞壁水解酶，其分子量约为25kDa，溶解细胞壁活性很强。通过对猪链球菌2型T15株的全基因组分析，发现如SEQ ID N0:2所示的序列与化脓链球菌噬菌体相关胞壁水解酶存在同源性，我们将SEQ ID NO: 2所示的序列命名为LytA。当猪链球菌2型T15株缺失LytA后，其酶谱试验发现，丢失25kDa处的溶解条带，说明了 LytA就是猪链球菌胞壁水解酶的编码基因。所述猪链球菌胞壁水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。虽然，以上提供了从猪链球菌2型T15株中获得LytA，但是，本领域内技术人员根据本专利技术公开的基因序列，采用其他方法，如合成法，同样能够得到LytA，这是显而易见的。 实施例2猪链球菌胞壁水解酶的表达及纯化:一.猪链球菌胞壁水解酶LytA基因的克隆根据猪链球菌胞壁水解酶基因LytA设计引物进行PCR扩增。上游引物LytA-F包含 EcoR I 酶切位点，序列为 GCGGAATTCATGACAACAGTAAATGAAGTAGTTAAITTTGCCAAAG (SEQIDNO: 3 )。下游引物 LytA-R 包含 Xho I 酶切位点，序列为 GCTCTCGAGCTATTTAAACGTACCATAAGGCACGAC (SEQ ID NO:4)。PCR扩增体系为:2XPfu PCR MasterMix (天根生化科技(北京)有限公司)12.5 μ L、10 μ M/L 的 LytA-Fl μ LUOy M/L 的 LytA-Rl μ L、猪链球菌 2 型 T15 株基因组0.5 μ L、双蒸水 10 μ L。PCR 扩增程序为:94°C预变性 5min ;94°C变性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 50s，30个循环；72°C延伸IOmin取5 μ L的PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，其余PCR产物用胶回收试剂盒(TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit)回收。二.重组表达载体的构建用限制性内切酶EcoR I和Xho I (TaKaRa)对PCR扩增产物进行双酶切，37°C温育4h，琼脂糖电泳回收酶切产物。用限制性内切酶EcoR I和Xho I对pET32a载体进行双酶切，37°C温育4h，琼脂糖电泳回收酶切产物。 双酶切反应体系如下:本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪链球菌胞壁水解酶，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种猪链球菌胞壁水解酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。2.编码权利要求1所述猪链球菌胞壁水解酶的基因。3.根据权利要求2所述基因，其特征在于:所述基因的序列如SEQID N0:2所示。4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体。5.根据权利要求4所述重组表达载体，其特征在于该重组表达载体是将猪链球菌胞壁水解酶的基因插入PET - 32a的...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆承平，张炜，琚存祥，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：