一种发状念珠藻基因组DNA的提取方法技术

本发明专利技术公开了一种发状念珠藻基因组DNA的提取方法：离心收集发状念珠藻纯培养细胞，依次用无菌水、1.0％NaCl溶液和无菌水清洗；匀浆破壁；采用以下提取液对DNA进行提取，提取液为：100mM Tris-HCl、20mM EDTANa2、1.4M NaCl、0.2％巯基乙醇、2.0％CTAB，pH＝8.0。本发明专利技术与现有的试剂盒提取方法相比，所涉及的实验操作简单，试剂易得，成本低，得率高。采用本发明专利技术提取的基因组DNA的OD260/OD280比值均在1.8左右，纯度高，无弥散现象，完整性好，可直接用于PCR、基因重组等高精度的分子生物学实验研究。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物学研宄的基础
，具体涉及一种高纯度发状念珠藻基因组 DNA的提取方法。
技术介绍
发菜（Nostoc flagelliforme)，又称发状念珠藻，是蓝菌门念珠藻目的细菌，广泛 分布于我国的沙漠和贫瘠土壤中，因其色黑而细长，如人的头发而得名。发菜富含各种营养 物质，尤其是发菜胞外多糖和发菜藻蓝蛋白，具有抗衰老、抗肿瘤、降血糖、抗凝血等功能， 食用和药用价值很高。日本微细藻类综合研宄所和富山医科药科大学的药理试验结果表 明，发菜多糖对单纯疱瘆病毒等具有明显的抗病毒活性。 由于发菜生长环境的特殊性和人工培育技术的滞后，原料短缺成为提取其功能活 性物质工业化的瓶颈。近年来，科研工作者采用基因工程技术等手段构建产发菜活性物质 的重组工程菌株，为直接转化生产其活性物质开辟了一条新途径。要实现这一途径，关键是 要获取高纯度的发菜基因组DNA，目前DNA提取方法主要有高盐低pH法、SDS裂解法、植物 基因组DNA提取试剂盒等。Rodrigo等利用CTAB法提取了珊瑚藻基因组DNA。Christine等 和Jang-Seu等分别用植物DNA试剂盒提取了衣藻Chlamydomonas和甲藻Dinoflafellate 的DNA，并对提取的DNA进行了分析。Elena等和Mo等也对一些微藻DNA进行提取研宄。这 些方法虽然可以提取到一定量的DNA，但是产率低，纯度差。 由于发状念珠藻的特殊性，故单纯地重复采用以上任何一种方法均不能很好地排 除胞外多糖、蛋白质、酚类等物质的干扰。这些物质的存在给DNA的提取和后续实验带来极 大的困难。如胞外多糖能抑制连接酶、聚合酶的生物酶活；蛋白质存在会造成DNA纯度下 降；酚类物质氧化可引起DNA降解、变色，影响后续试验的进行。另外，实验室常用的植物 基因组DNA提取试剂盒是离心柱型试剂盒，需过吸附柱，DNA得率低，纯度差，样品的花费较 尚。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种发状念珠藻基因组DNA的提取方法，可以获得OD26tl/ OD28tl比值在1. 8左右的高纯度发状念珠藻基因组DNA。 为达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案： 该提取方法包括以下步骤： 1)离心收集发状念珠藻培养细胞，依次用无菌水、质量分数0.8~1.2%的NaCl 水溶液以及无菌水清洗所述细胞； 2)经过步骤1)后，对所述细胞进行破壁，然后离心收集破碎后的细胞； 3)称取0. 1~0. 3g所述破碎后的细胞并转入装有2000~4000 μ L 65°C预热提 取液的离心管中，充分混匀后置于65°C水浴中50~70min，其间摇动所述离心管若干次，得 混合物；所述提取液的制备方法为：向无菌水中加入Tris-HCl母液、EDTANa2、NaCl、巯基乙 醇以及CTAB，得到含有100~105mMTris-HCl、20~22mMEDTANa2、1.4~1.5MNaCl、体积 分数0. 2~0. 25 %的巯基乙醇以及质量分数2. O~2. 2 %的CTAB的混合溶液，然后用NaOH 调节混合溶液的pH至8. 0,得提取液； 4)向混合物中加入氯仿与异戊醇的混合液并翻动至不分相，然后离心并收集上清 液；所述氯仿与异戊醇的体积比为24:1 ; 5)对上清液按照步骤4)重复处理1~2次，向最后一次得到的上清液中加入异丙 醇，然后于_18~_20°C静置30~45min ; 6)离心收集步骤5)中静置过程析出的白色沉淀，依次用500~800 yL 75%乙醇 和60~90 μ L I. 5mol/L的NaAc水溶液的混合液、75%乙醇以及无水乙醇洗涤白色沉淀， 洗涤后自然风干。 所述步骤1)中依次用无菌水、质量分数1. 0%的NaCl水溶液以及无菌水清洗所述 细胞各2次，每次清洗后于4°C以及4000~6000r/min下离心8~12min收集细胞。 所述破壁的方式为采用玻璃匀浆器进行2~3次匀浆。 所述提取液各组分的浓度为：100mM Tris-HCl、20mM EDTANa2U. 4M NaCl、体积分 数0. 2%的巯基乙醇以及质量分数2. 0%的CTAB，所述提取液的pH为8. 0。 所述提取方法具体包括以下步骤： a)离心收集处于生长对数期的发状念珠藻纯培养细胞，将所述细胞依次用无菌水 清洗2次、质量分数I. 0%的NaCl水溶液清洗2次，再用无菌水清洗2次，每次清洗后于4°C 以及4000~6000r/min下离心8~12min收集细胞； b)用玻璃匀浆器对经过步骤a)清洗后的细胞进行二次匀浆破壁，然后于4°C以及 4000~6000r/min下离心8~12min并收集沉淀于底部的破碎后的细胞； c)称取0. 1~0. 3g所述破碎后的细胞并转入装有2000~4000 μ L 65°C预热提 取液的离心管中，充分混匀后置于65°C水浴中50~70min，其间每隔15min摇动所述离心 管1次，得混合物；所述提取液的制备方法为：向无菌水中加入Tris-HCl母液、EDTANa2、 NaCl、巯基乙醇以及 CTAB，得到含有 IOOmM Tris-HCl、20mM EDTANa2U. 4M NaCl、体积分数 0. 2%的巯基乙醇以及质量分数2. 0%的CTAB的混合溶液，然后用NaOH调节混合溶液的pH 至8. 0,得提取液； d)向混合物中加入氯仿与异戊醇的混合液并翻动至不分相，然后离心并收集上清 液；所述氯仿与异戊醇的体积比为24:1 ; e)对上清液按照步骤d)重复处理1~2次，向最后一次得到的上清液中加入异丙 醇，然后于_20°C静置30~45min ; f)通过4°C以及12000r/min下离心8~12min收集步骤e)中静置过程析出的白 色沉淀； g)用500~800 μ L 75%乙醇和60~90 μ L I. 5mol/L的NaAc水溶液使白色沉 淀悬浮后静置30min，然后于4°C以及6000~9000r/min下离心10min，弃上清液； h)将步骤g)离心得到的沉淀用800 μ L 75%乙醇悬浮后静置30min，然后于4°C 以及6000r/min下离心10min，弃上清液； i)将步骤h)离心得到的沉淀用无水乙醇悬浮后静置30min，然后于4°C以及 6000r/min下离心10min，弃上清液并自然风干沉淀。 与现有技术相比，本专利技术具有以下有益的技术效果： (1)本专利技术采用无菌水、NaCl水溶液和无菌水清洗细胞的方式，使细胞表面的杂 质和胞外多糖含量降到最低，减少培养液中营养物质（如无机盐）和糖类对提取DNA的污 染，减少残糖对后续PCR、酶切等抑制作用； (2)本专利技术使用所述提取液提取发状念珠藻基因组DNA，其OD26Q/OD 28Q比值均在 1. 8左右，纯度良好，且PCR验证试验获得了条带清晰、重复性好的扩增结果，同时该提取液 的毒性大大降低。 (3)与植物试剂盒提取方法相比，具有试验步骤少，操作简单，试剂易得，提取成本 低，电泳条带单一、清晰、无弥散等特点，提取的基因组DNA可直接用于PCR、基因重组等高 精度的分子生物学实验研宄。 此外，离心收集处于生长对数期的发状念珠藻纯培养细胞，可以减少直接采用野 生发菜提取对DN本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种发状念珠藻基因组DNA的提取方法，其特征在于：该提取方法包括以下步骤：1)离心收集发状念珠藻培养细胞，依次用无菌水、质量分数0.8～1.2％的NaCl水溶液以及无菌水清洗所述细胞；2)经过步骤1)后，对所述细胞进行破壁，然后离心收集破碎后的细胞；3)称取0.1～0.3g所述破碎后的细胞并转入装有2000～4000μL 65℃预热提取液的离心管中，充分混匀后置于65℃水浴中50～70min，其间摇动所述离心管若干次，得混合物；所述提取液的制备方法为：向无菌水中加入Tris‑HCl母液、EDTANa2、NaCl、巯基乙醇以及CTAB，得到含有100～105mM Tris‑HCl、20～22mM EDTANa2、1.4～1.5M NaCl、体积分数0.2～0.25％的巯基乙醇以及质量分数2.0～2.2％的CTAB的混合溶液，然后用NaOH调节混合溶液的pH至8.0，得提取液；4)向混合物中加入氯仿与异戊醇的混合液并翻动至不分相，然后离心并收集上清液；所述氯仿与异戊醇的体积比为24:1；5)对上清液按照步骤4)重复处理1～2次，向最后一次得到的上清液中加入异丙醇，然后于‑18～‑20℃静置30～45min；6)离心收集步骤5)中静置过程析出的白色沉淀，依次用500～800μL 75％乙醇和60～90μL 1.5mol/L的NaAc水溶液的混合液、75％乙醇以及无水乙醇洗涤白色沉淀，洗涤后自然风干。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈雪峰，马文锦，侯令，范华，刘宁，焦文冬，徐瑶，蔡国强，
申请(专利权)人：陕西科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61