本发明专利技术涉及生物领域，公开了一种用于适配子筛选的DNA双链分离方法以及适配子筛选方法和新的适配子；所述分离方法包括：1)取FITC-ssDNA亚文库溶液用酸进行中和；2)进行高分辨率琼脂糖电泳；3)分离ssDNA亚文库及其中的污染序列，切取ssDNA亚文库的目标条带，通过小分子量DNA纯化回收试剂盒进行回收，即得；所述适配子筛选方法还包括：1-1)准备随机ssDNA文库及引物；1-2)孵育筛选；1-3)扩增；1-4)取dsDNA与固定有链亲合素的磁珠进行孵育，然后加入碱性溶液即得；本发明专利技术新的适配子具有如SEQ ID NO.1或SEQNO.2所示的核苷酸序列。本发明专利技术提高了DNA双链分离效率，降低链亲合素及Biotin-ssDNA对ssDNA亚文库的污染，改善了筛选孵育过程中的细胞生存状态，提高cell-SELEX的成功率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物学
，具体涉及一种以细胞为靶的核酸适配子筛选过程中 DNA双链的分离方法以及适配子的筛选方法及新的适配子。
技术介绍
核酸适配子（aptamer)是通过指数富集配基的系统进化技术（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)筛选得到的、能特异结合革巴 物质的单链寡聚核苷酸（ssDNA或RNA)。核酸适配子与抗体功能类似，但是与抗体相比，核 酸适配子具有更多优势，如更高的亲和力与特异性、无免疫原性、能化学合成、成本低、可化 学标记、稳定性好、易于保存等。而且，核酸适配子的靶物质更为广泛，包括金属离子、氨基 酸、核酸、多肽、蛋白质，并从单一靶标扩展至完整的病毒颗粒和细胞等复合物靶标。因 此，近年来核酸适配子不断被应用于基础研究、药物开发、临床应用等方面。同时，核酸适配 子的筛选技术也得到不断发展，适用性、简便性不断改善。以细胞为靶的适配子筛选技 术，即cell-SELEX，是在原SELEX基础上发展起来的细胞筛选技术，该技术是以活细胞为筛 选对象，不需要事先了解靶细胞表面的分子特征，通过引入非靶细胞进行反筛获得特异性 识别靶细胞的核酸适配子。其筛选过程主要包括以下几个步骤:①构建文库：体外合成 中间为30-60nt的随机序列、两端为18-40nt的固定序列的单链寡核苷酸文库；②孵育筛 选：将该文库与靶细胞孵育，收集与靶标特异结合的核酸，然后再与非靶细胞孵育，收集未 结合核酸；③扩增（PCR) :PCR扩增与靶细胞结合、同时与非靶细胞不结合的核酸，得到双链 DNA (dsDNA);④分离：分离dsDNA,获得单链DNA (ssDNA)亚文库,或转录得到RNA亚文库；⑤ 富集：重复上述过程5-20个循环，一些与靶标有高亲和力和高特异性的DNA或RNA分子不 断得到富集；⑥克隆鉴定：流式细胞仪检测ssDNA的富集情况，待富集达到一定程度时，进 行克隆、测序和鉴定。 在Cell-SELEX筛选适配子的过程中，分离双链PCR产物，获得可用于后续筛选的 单链DNA亚文库是整个过程的限速步骤。目前，分离双链PCR产物最经典方法的是生物 素-链亲合素-磁珠法。该方法利用生物素与链亲合素的结合特性，该方法包括：首先合成 正向引物和反向引物，反向引物进行生物素（Biotin)标记；然后，PCR扩增得到生物素标记 的dsDNA产物，将dsDNA浓缩纯化后，与固定有链亲合素（Streptavidin)的磁珠孵育，碱变 性法打破dsDNA之间的氢键，使得Biotin-ssDNA与链亲合素结合后固定在磁珠上，游离的 另一条ssDNA则被分离出来，作为后续筛选的亚文库。然而，最近的研究报道表明，该方 法在碱变性后会打破链亲合素与生物素之间的相互作用，使得Biotin-ssDNA脱落下来，污 染ssDNA亚文库，二者重新发生退火反应形成双链DNAm。另外，碱变性也会破坏链亲合素 与磁珠之间的共价键偶联，脱落的链亲合素混入ssDNA文库，在后续与细胞孵育的过程中 造成细胞的聚集，影响细胞的生存状态。 因此，有必要对传统的生物素-链亲合素-磁珠法进行改良，提高双链分离效率， 降低链亲合素及Biotin-ssDNA对ssDNA亚文库的污染，改善筛选孵育过程中的细胞生存状 态，提高cell-SELEX的成功率。
技术实现思路
针对以上现有技术现状，本专利技术提供了一种新的核酸适配子筛选过程中DNA双链 的分离方法，并进一步提供一种改进的核酸适配子的筛选方法，本专利技术通过在生物素-链 亲合素-磁珠法获得ssDNA亚文库后引入高分辨率琼脂糖电泳，对ssDNA亚文库进行进一 步分离纯化，纯化后的亚文库继续用于后续cell-SELEX筛选，可以成功地筛选细胞特异性 适配子。 本专利技术所述适配子筛选过程中DNA双链的分离方法，包括如下步骤： 1)取由生物素-链亲合素-磁珠法及碱变性法获得的萤光素（FITC)-ssDNA亚文 库溶液用酸进行中和； 2)将步骤1)所得中和后溶液进行高分辨率琼脂糖电泳； 3)分离ssDNA亚文库及其中的污染序列，切取ssDNA亚文库的目标条带，通过小分 子量DNA纯化回收试剂盒进行回收，即得。 本专利技术方法步骤1)中所述生物素-链亲合素-磁珠法及碱变性法获得的 FITC-ssDNA亚文库溶液可来源不受任何限制，可以为本领域常规实验条件下生物素-链亲 合素-磁珠法及碱变性法获得的FITC-ssDNA亚文库溶液。 作为本专利技术实施方式之一，所述分离方法中步骤1)中的酸选自盐酸或醋酸溶液； 所述酸的浓度范围为50mM-300mM ;进一步优选盐酸溶液的浓度为200mM。 作为本专利技术实施方式之一，所述分离方法中步骤2)中的高分辨琼脂糖电泳的条 件为：分辨率为20-1000bp，温度为室温，电泳时间为30min-lhr，电压为150-180V。 本专利技术方法步骤3)中分离ssDNA亚文库及其中的污染序列，所述分离方法可以 采用本领域常规的分离方法；所述步骤3)中切取ssDNA亚文库的目标条带，通过小分子量 DNA纯化回收试剂盒进行回收，可以采用本领常规的技术方式进行；本专利技术包括但不限于 用溴化乙锭染色10分钟，紫外灯下切取FITC-ssDNA的目标条带，通过小分子量DNA纯化回 收试剂盒进行回收。 作为本专利技术实施方式之一，所述分离方法中步骤3)中的小分子纯化试剂盒选自 20bp-100bp分子量范围的小分子DNA纯化试剂盒。 本专利技术还提供一种采用本专利技术分离方法的核酸适配子的筛选方法，所述筛选方法 还包括由生物素-链亲合素-磁珠法及碱变性法获得的FITC-ssDNA亚文库溶液按以下步 骤制得： 1-1)准备随机ssDNA文库，FITC标记的正向引物和Biotin标记的反向引物； 1-2)取靶向细胞与随机ssDNA文库进行孵育，然后收集含有与靶向细胞结合的 ssDNA的上清液； 1-3)取上述靶向细胞结合的ssDNA与非靶细胞进行孵育，收集与非靶细胞不结合 的ssDNA进行PCR扩增，得到dsDNA ; 1-4)取dsDNA与固定有链亲合素的磁珠进行孵育，然后加入碱性溶液即得。 本专利技术所述核酸适配子的筛选方法中，作为实施方式之一，所述方法中步骤1-1) 中ssDNA随机文库选自 5，-ATCCAGAGTGACGCAGCA-40nt-TGGACACGGTGGCTTAGT-3，、或 5' -GCAATGGTACGGTACTTCC-40nt-CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTA-3' ； 本专利技术方法中，作为实施方式之一，所述FITC标记的正向引物选自： 5,引物：5, -FITC-ATCCAGAGTGACGCAGCA-3,或 5' -FITC-GCAATGGTACGGTACTTCC-3' ； 本专利技术方法中，作为实施方式之一，所述Biotin标记的反向引物选自： 3' 引物：5, -biotin-ACTAAGCCACCGTGTCCA-3' 或 5' -biotin-TTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTTG-3' ； 本专利技术核酸适配子的筛选方法中，作为实施方式之一，所述方法中步骤1-2)中靶 向细胞，本领域技术人员本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于核酸适配子筛选中DNA双链的分离方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：1)取由生物素‑链亲合素‑磁珠法及碱变性法获得的FITC‑ssDNA亚文库溶液用酸进行中和；2)将步骤1)所得中和后溶液进行高分辨率琼脂糖电泳；3)分离ssDNA亚文库及其中的污染序列，切取ssDNA亚文库的目标条带，通过小分子量DNA纯化回收试剂盒进行回收，即得。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：梁超，李德芳，何小鹃，吕诚，姜淼，牛旭艳，刘彪，郭保生，刘进，何冰，党蕾，张戈，吕爱平，
申请(专利权)人：中国中医科学院中医临床基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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