本发明专利技术提供一种利用特异性引物对紫背浮萍Sp10微卫星标记检测的方法，检测方法如下：1）材料预处理：采集紫背浮萍样品，驯养，封装，干燥，待用；2）紫背浮萍基因组DNA提取：3）设计特异性引物：微卫星点Sp10特异性引物：F:CCATCTGTCGTCCTTTTTCCC R:CGCCCCATCACTTATTTCGTA；4）利用上述引物对紫背浮萍不同地理群内个体的基因组DNA进行PCR扩增；5）对PRC产物初筛，加上样缓冲液，变性后于变性聚丙烯酰胺凝胶进行垂直电泳分析，从而获得紫背浮萍在Sp10核心序列区高度遗传变异的多态性图谱。本发明专利技术可快捷的获得紫背浮萍Sp10遗传标记基因座呈现高度遗传变异的多态性图谱，方法简便。
【技术实现步骤摘要】
利用特异性引物对紫背浮萍Sp10微卫星标记检测的方法
本专利技术属于DNA分子标记
，具体涉及一种利用特异性引物对紫背浮萍Sp10微卫星标记检测的方法。
技术介绍
微卫星（microsatellites）或称简单重复序列（simplesequencerepeats,SSR）是指由1-6个核苷酸组成的简单串联重复DNA序列，几乎存在于迄今研究过的所有生物当中，并且分布密度很大。因微卫星广泛分布于基因组中，具有密度大、多态性丰富、高度杂合且稳定性好、遵循孟德尔分离定律共显性遗传、易于PCR扩增等特点，已成为近年来广泛应用的DNA标记，常应用于生物资源的家系谱系认证、基因连锁分析、遗传图谱构建、种质鉴定、种群遗传多样性等许多研究领域。在自然环境中，紫背浮萍基本以无性生殖进行繁殖，当环境条件适宜时2天即可克隆出一代，种群遗传多样性水平较低。现有技术提供多种卫星标记的检测方法，例如，中国专利技术授权专利文献一种锈斑蟳微卫星标记的快速检测方法授权公告号CN103305611B该专利技术涉及一种锈斑蟳微卫星标记的快速检测方法，包括：（1）锈斑蟳基因组DNA的提取；（2）根据GeneBank数据库中锈斑蟳的功能基因序列，获得含有微卫星重复的基因序列；（3）微卫星标记引物的设计；（4）锈斑蟳不同个体的基因组DNA的PCR扩增；（5）PCR产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。该专利技术的检测方法具有快速、准确、灵敏等优点，能够直观地检测出锈斑蟳不同个体的基因型，从而快速获得锈斑蟳在功能基因微卫星位点遗传变异的多态性图谱，该微卫星标记可应用于锈斑蟳遗传变异与种群遗传多样性分析等领域，但微卫星标记检测速度还有提升空间。
技术实现思路
本专利技术针对上述技术问题提供一种紫背浮萍Sp10微卫星DNA标记的检测方法，可快捷的获得紫背浮萍Sp10遗传标记基因座呈现高度遗传变异的多态性图谱，方法简便，所得结果可直观地检测出紫背浮萍在此位点的每个个体的基因型。本专利技术针对上述技术问题所采取的方案为：利用特异性引物对紫背浮萍Sp10微卫星标记检测的方法，检测方法如下：1）材料预处理：采集紫背浮萍样品，驯养，封装，干燥，待用；2）紫背浮萍基因组DNA提取：a在水浴锅中预热CTAB提取液；b研磨样品并转入离心管中，加入提取液，保温，颠倒混匀；c离心，取上清液；d加入酚/氯仿，混匀，离心，取上清液；e加入氯仿，混匀，离心，取上清液；f重复d、e1~2次；g加入异丙醇混匀，沉淀，离心，弃上清液；h将沉淀物用乙醇漂洗，离心，弃上清液；i重复h；j检测，低温保存，备用；3）设计特异性引物：微卫星点Sp10特异性引物：F:CCATCTGTCGTCCTTTTTCCCR:CGCCCCATCACTTATTTCGTA；4）利用上述引物对紫背浮萍不同地理群内个体的基因组DNA进行PCR扩增；5）对PRC产物初筛，加上样缓冲液，变性后于变性聚丙烯酰胺凝胶进行垂直电泳分析，从而获得紫背浮萍在Sp10核心序列区高度遗传变异的多态性图谱。可快捷的获得紫背浮萍Sp10遗传标记基因座呈现高度遗传变异的多态性图谱，方法简便，所得结果可直观地检测出紫背浮萍在此位点的每个个体的基因型。步骤1中采集紫背浮萍样品，驯养3~5天，通过人工驯养的方式使野生状态下的紫背浮萍以无性繁殖的方式进行繁殖，获得较多的样品。步骤2DNA提取法为改良的CTAB法，通过对CTAB法进行改良，获得的DNA质量优异，提取过程中无明显的DNA降解。步骤2中b在液氮中研磨样品后转入离心管中，加入提取液，60~68℃保温30~60min，每隔10min轻轻颠倒混匀，使样品充分溶解在提取液中，通过颠倒混匀提高提取效果。步骤2中h将沉淀物用65~75%乙醇漂洗，离心，弃上清液，通过乙醇漂洗使核酸充分的分离出来。步骤2中j提取产物取2~3μl用1.0~2.0%琼脂糖凝胶电泳检测，其余置于‐10~-30℃保存备用，采用的凝胶电泳方法简单、快速、灵敏的特点。步骤2中a在60~70℃水浴锅中预热CTAB提取液，CTAB提取液由以下成分及重量份组成：CTAB3~5份、1MTris-HCl18~22份、NaCl14~18份、0.5MEDTA6~10份、三甲基硅基0.02~0.08份、2-巯基乙醇0.2~1份、氨基乙酸0.03~0.06份、氯仿90~98份、异戊醇3~5份。通过预热抑制DNase,加速蛋白变性,促进DNA溶解，获得优异的提取效果，DNA质量优异，且提取速度较快。步骤5中先将PCR产物进行琼脂糖初筛，选择有扩增的引物PCR产物加上样缓冲液，92~95℃变性8~12min后于5~7%变性聚丙烯酰胺凝胶进行垂直电泳分析，采用的凝胶电泳方法简单、快速、灵敏的特点。步骤5中的上样缓冲液由以下成分及重量份组成：二甲酚橙0.05~0.18份、柠檬黄0.1~0.25份、溴酚蓝0.01~0.05份、二甲苯青FF0.05~0.18份、硬脂酸甘油酯0.02~0.06份、丙三醇35~37份、六氰合铁酸钾0.01~0.02份、乙二胺四乙酸二钠2.8~3.2份、甲酸酐0.04~0.08份、十二烷基硫酸钠3~5份。可增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内，使样品呈色，操作方便。有益效果：本专利技术具有速度快、准确性和灵敏度高的优点，可快捷的获得紫背浮萍Sp10遗传标记基因座呈现高度遗传变异的多态性图谱，方法简便，所得结果可直观地检测出紫背浮萍在此位点的每个个体的基因型。具体实施例以下结合实施例作进一步详细描述：实施例1：利用特异性引物对紫背浮萍Sp10微卫星标记检测的方法，检测方法如下：1）材料预处理：采集紫背浮萍样品，驯养，封装，干燥，待用；2）紫背浮萍基因组DNA提取：a在水浴锅中预热CTAB提取液；b研磨样品并转入离心管中，加入提取液，保温，颠倒混匀；c离心，取上清液；d加入酚/氯仿，混匀，离心，取上清液；e加入氯仿，混匀，离心，取上清液；f重复d、e1~2次；g加入异丙醇混匀，沉淀，离心，弃上清液；h将沉淀物用乙醇漂洗，离心，弃上清液；i重复h；j检测，低温保存，备用；3）设计特异性引物：微卫星点Sp10特异性引物：F:CCATCTGTCGTCCTTTTTCCCR:CGCCCCATCACTTATTTCGTA；4）利用上述引物对紫背浮萍不同地理群内个体的基因组DNA进行PCR扩增；5）对PRC产物初筛，加上样缓冲液，变性后于变性聚丙烯酰胺凝胶进行垂直电泳分析，从而获得紫背浮萍在Sp10核心序列区高度遗传变异的多态性图谱。可快捷的获得紫背浮萍Sp10遗传标记基因座呈现高度遗传变异的多态性图谱，方法简便，所得结果可直观地检测出紫背浮萍在此位点的每个个体的基因型。步骤1中采集紫背浮萍样品，驯养3~5天，通过人工驯养的方式使野生状态下的紫背浮萍以无性繁殖的方式进行繁殖，获得较多的样品。步骤2DNA提取法为改良的CTAB法，通过对CTAB法进行改良，获得的DNA质量优异，提取过程中无明显的DNA降解。步骤2中b在液氮中研磨样品后转入离心管中，加入提取液，60~68℃保温30~60min，每隔10min轻轻颠倒混匀，使样品充分溶解在提取液中，通过颠倒混匀提高提取效果。步骤2中h将沉淀物用65~75%乙醇漂洗，离心，弃上清液，通过乙醇漂洗使核酸充本文档来自技高网...
【技术保护点】
利用特异性引物对紫背浮萍Sp10微卫星标记检测的方法，其特征在于：检测方法如下：1）材料预处理：采集紫背浮萍样品，驯养，封装，干燥，待用；2）紫背浮萍基因组DNA提取：a在水浴锅中预热CTAB提取液；b研磨样品并转入离心管中，加入提取液，保温，颠倒混匀；c离心，取上清液；d加入酚/氯仿，混匀，离心，取上清液；e加入氯仿，混匀，离心，取上清液；f重复d、e 1~2次；g加入异丙醇混匀，沉淀，离心，弃上清液；h将沉淀物用乙醇漂洗，离心，弃上清液；i重复h；j检测，低温保存，备用；3）设计特异性引物：微卫星点Sp10特异性引物：F: CCATCTGTCGTCCTTTTTCCCR: CGCCCCATCACTTATTTCGTA；4）利用上述引物对紫背浮萍不同地理群内个体的基因组DNA进行PCR扩增；5）对PRC产物初筛，加上样缓冲液，变性后于变性聚丙烯酰胺凝胶进行垂直电泳分析，从而获得紫背浮萍在Sp10核心序列区高度遗传变异的多态性图谱。
【技术特征摘要】
1.利用特异性引物对紫背浮萍Sp10微卫星标记检测的方法，其特征在于：检测方法如下：1）材料预处理：采集紫背浮萍样品，驯养，封装，干燥，待用；2）紫背浮萍基因组DNA提取：a在水浴锅中预热CTAB提取液；b研磨样品并转入离心管中，加入提取液，保温，颠倒混匀；c离心，取上清液；d加入酚/氯仿，混匀，离心，取上清液；e加入氯仿，混匀，离心，取上清液；f重复d、e1~2次；g加入异丙醇混匀，沉淀，离心，弃上清液；h将沉淀物用乙醇漂洗，离心，弃上清液；i重复h；j检测，低温保存，备用；3）设计特异性引物：微卫星点Sp10特异性引物：F:CCATCTGTCGTCCTTTTTCCCR:CGCCCCATCACTTATTTCGTA；4）利用上述引物对紫背浮萍不同地理群内个体的基因组DNA进行PCR扩增；5）对PRC产物初筛，加上样缓冲液，变性后于变性聚丙烯酰胺凝胶进行垂直电泳分析，从而获得紫背浮萍在Sp10核心序列区高度遗传变异的多态性图谱。2.根据权利要求1所述的利用特异性引物对紫背浮萍Sp10微卫星标记检测的方法，其特征在于：所述步骤1中采集紫背浮萍样品，驯养3~5天。3.根据权利要求1所述的利用特异性引物对紫背浮萍Sp10微卫星标记检测的方法，其特征在于：所述步骤2DNA提取法为改良的CTAB法。4.根据权利要求1所述的利用特异性引物对紫背浮萍Sp10微卫星标记检测的方法，其特征在于：所述步骤2中b在液氮中研磨样品后转入离心管中，加入提取液，60~68℃保温30~60min，每隔10min颠倒混匀。5.根据权利要求1所述的利用特异性引物对紫背浮萍Sp10微卫星标记...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐娜娜，朱明栋，胡芳露，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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