一种SNP分型方法及试剂盒技术

本发明专利技术涉及DNA检测技术领域，提供了一种SNP分型方法及试剂盒。待测SNP位点包括CYP2C9、VKORC1和CYP2C19基因中的SNP位点，所述SNP分型方法利用无荧光标记的寡核苷酸探针替换有荧光标记的寡核苷酸探针，对待测序文库分子进行一次连接测序反应后，再通过连接测序获得待测SNP位点的序列信息。所述SNP分型试剂盒，包括CYP2C9特异性引物对、VKORC1特异性引物对、CYP2C19特异性引物对、无荧光标记的寡核苷酸探针。本发明专利技术的SNP分型方法及试剂盒通过封闭待测序文库分子中的非特异性结合位点，降低了连接测序所得结果中的错误信号，从而提高了SNP位点检测的准确性。

【技术实现步骤摘要】
一种SNP分型方法及试剂盒
本专利技术涉及DNA检测
，更具体地说，涉及一种SNP分型方法及试剂盒。
技术介绍
单核苷酸多态性（SingleNucleotidePolymorphism，SNP）是指基因组内DNA中某一特定核苷酸位置上存在转换、颠换、插入、缺失等变化。目前，国内外常见的SNP分型检测技术包括以下几种，高分辨率融解曲线检测法（highresolutionmelting，HRM）、基于芯片技术的SNP分型方法、等位基因特异性扩增法（AmplificationRefractoryMutationSystemRealTimePCR，ARMS-RTPCR）、Taqman荧光探针法、质谱法、高效液相层析法和基因测序法等。其中，基因测序法又包括以Sanger技术为基础的第一代测序技术，和具有高通量、低成本特点的第二代高通量测序技术。第二代高通量测序技术包括连接测序法和合成测序法。其中，所述连接测序法是基于连接酶在核酸片段之间进行连接反应的过程中的保真性来实现的，以待测序核酸片段为模板，锚定引物（又称测序引物，其与待测序核酸片段所在链互补）和寡核苷酸探针（该探针的特定位置上带有荧光标记）进行连接反应，通过检测连接产物上的荧光标记从而确定寡核苷酸探针上带有荧光标记的特定位置对应的序列的信息。所述合成测序法是基于聚合酶在延伸核酸链过程中的保真性来实现的，以待测序核酸片段为模板，锚定引物互补结合至待测序核酸片段上，通过检测在延伸过程中产生的信号来确定待测序核酸片段上相应位置的序列信息。在CN201410168995.2中，披露了一种基于连接测序技术的SNP分型方法，本申请专利技术人在利用该技术对CYP2C9、VKORC1和CYP2C19基因中的SNP位点进行检测时发现，所得测序结果中存在一定比例的错误信号，而这些错误信号将会干扰测序结果的分析，降低SNP位点检测的准确性。因此需要一种新的SNP分型方法和试剂盒，以提高对CYP2C9、VKORC1和CYP2C19基因中的SNP位点检测的准确性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种对CYP2C9、VKORC1和CYP2C19基因中的SNP位点检测准确率更高的SNP分型方法和试剂盒，旨在解决现有技术中测序结果中存在较高比例的错误信号的技术问题。为了实现专利技术目的，一种SNP分型方法，待测SNP位点包括CYP2C9、VKORC1和CYP2C19基因中的SNP位点，所述SNP分型方法包括以下步骤：A、含待测SNP位点核酸片段的获得：利用CYP2C9特异性引物对、VKORC1特异性引物对和CYP2C19特异性引物对分别对待测样本进行PCR扩增，得CYP2C9扩增产物、VKORC1扩增产物和CYP2C19扩增产物；B、待测序文库分子的构建：将CYP2C9扩增产物、VKORC1扩增产物和CYP2C19扩增产物分别与接头连接，形成相应的待测序文库分子，并将待测序文库分子通过微球可寻址的固定在固相载体上；C、封闭非特异性结合位点：利用无荧光标记的寡核苷酸探针替换有荧光标记的寡核苷酸探针，对固定在固相载体上的待测序文库分子进行一次连接测序反应；D、连接测序获得待测SNP位点的序列信息。其中，所述步骤C包括以下步骤：C1、将锚定引物锚定在待测序文库分子上；C2、加入无荧光标记的寡核苷酸探针、连接酶以及相应的缓冲液，进行连接反应；C3、变性去除连接产物。其中，所述CYP2C9特异性引物对、VKORC1特异性引物对和CYP2C19特异性引物对中均至少有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列。其中，所述CYP2C9特异性引物对、VKORC1特异性引物对和CYP2C19特异性引物对均包括外引物对和内引物对；所述CYP2C9、VKORC1和CYP2C19内引物对中均至少有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列。其中，所述步骤A包括以下步骤:A1、利用CYP2C9、VKORC1和CYP2C19外引物对分别对待测样本进行PCR扩增，得CYP2C9第一次扩增产物、VKORC1第一次扩增产物和CYP2C19第一次扩增产物；A2、分别以CYP2C9第一次扩增产物、VKORC1第一次扩增产物和CYP2C19第一次扩增产物为模板，利用相应的CYP2C9、VKORC1和CYP2C19内引物对分别进行PCR扩增，得CYP2C9第二次扩增产物、VKORC1第二次扩增产物和CYP2C19第二次扩增产物。其中，所述步骤B包括以下步骤：B1、将CYP2C9扩增产物、VKORC1扩增产物和CYP2C19扩增产物分别与固定在微球上的接头连接，得固定在微球上的待测序文库分子；B2、将微球可寻址的固定在固相载体上。其中，所述步骤B1中的连接反应是在切割-连接反应体系中进行的，所述切割-连接反应体系包括：连接酶、断裂剂、固定在微球上的第一接头和连接缓冲液；所述断裂剂，用于对核酸片段中的可断裂位点或可切除序列进行特异性切割，形成第一粘性末端；所述第一接头为核酸分子，含有与第一粘性末端完全互补配对的第二粘性末端。其中，步骤B1中所述连接缓冲液中含有5-10%PEG。其中，所述待测SNP位点的rs号分别为：rs1799853、rs1057910、rs9923231、rs4244285和rs4986893。为了更好的实现本专利技术的目的，本专利技术还提供了一种SNP分型试剂盒，包括CYP2C9特异性引物对、VKORC1特异性引物对、CYP2C19特异性引物对、无荧光标记的寡核苷酸探针。其中，所述CYP2C9特异性引物对、VKORC1特异性引物对和CYP2C19特异性引物对中均至少有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列。其中，所述CYP2C9特异性引物对、VKORC1特异性引物对和CYP2C19特异性引物对均包括外引物对和内引物对；所述CYP2C9、VKORC1和CYP2C19内引物对中均至少有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列。其中，还包括建库连接缓冲液，所述建库连接缓冲液中含有5-10%PEG。由上可知，本专利技术的SNP分型方法及试剂盒，通过封闭待测序文库分子中的非特异性结合位点，降低了连接测序所得结果中的错误信号，从而提高了CYP2C9、VKORC1和CYP2C19基因中的SNP位点检测的准确性。附图说明图1是本专利技术一个具体实施例中第一接头的结构示意图。图2是本专利技术一个具体实施例中第一接头的标签序列与样本来源和SNP位点的对应关系图。图3是本专利技术一个具体实施例中各SNP位点与所对应使用的锚定引物关系图。图4是本专利技术一个具体实施例中实验组测序流程图。图5是本专利技术一个具体实施例中对照组测序流程图。图6是本专利技术一个具体实施例中部分初步实验结果对照图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。本专利技术提出第一典型实施例，一种SNP分型方法，待测SNP位点包括CYP2C9、VKORC1和CYP2C19基因中的SNP位点，所述SNP分型方法包括以下步骤：A、含待测SNP位点核酸片段的获得：利用CYP2C9特异性引物对、VKORC1特异性引物对和CYP2C19特异性引物对分别对待测样本进行PCR扩增，得CYP2C9扩增产物、VKORC1扩增产物和CYP2C1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种SNP分型方法，其特征在于，待测SNP位点包括CYP2C9、VKORC1和CYP2C19基因中的SNP位点，所述SNP分型方法包括以下步骤：A、含待测SNP位点核酸片段的获得：利用CYP2C9特异性引物对、VKORC1特异性引物对和CYP2C19特异性引物对分别对待测样本进行PCR扩增，得CYP2C9扩增产物、VKORC1扩增产物和CYP2C19扩增产物；B、待测序文库分子的构建：将CYP2C9扩增产物、VKORC1扩增产物和CYP2C19扩增产物分别与接头连接，形成相应的待测序文库分子，并将待测序文库分子通过微球可寻址的固定在固相载体上；C、封闭非特异性结合位点：利用无荧光标记的寡核苷酸探针替换有荧光标记的寡核苷酸探针，对固定在固相载体上的待测序文库分子进行一次连接测序反应；D、连接测序获得待测SNP位点的序列信息。

【技术特征摘要】
1.一种SNP分型方法，其特征在于，待测SNP位点包括CYP2C9、VKORC1和CYP2C19基因中的SNP位点，所述SNP分型方法包括以下步骤：A、含待测SNP位点核酸片段的获得：利用CYP2C9特异性引物对、VKORC1特异性引物对和CYP2C19特异性引物对分别对待测样本进行PCR扩增，得CYP2C9扩增产物、VKORC1扩增产物和CYP2C19扩增产物；B、待测序文库分子的构建：将CYP2C9扩增产物、VKORC1扩增产物和CYP2C19扩增产物分别与接头连接，形成相应的待测序文库分子，并将待测序文库分子通过微球可寻址的固定在固相载体上；C、封闭非特异性结合位点：利用无荧光标记的寡核苷酸探针替换有荧光标记的寡核苷酸探针，对固定在固相载体上的待测序文库分子进行一次连接测序反应；D、连接测序获得待测SNP位点的序列信息。2.根据权利要求1所述的SNP分型方法，其特征在于，所述步骤C包括以下步骤：C1、将锚定引物锚定在待测序文库分子上；C2、加入无荧光标记的寡核苷酸探针、连接酶以及相应的缓冲液，进行连接反应；C3、变性去除连接产物。3.根据权利要求1所述的SNP分型方法，其特征在于，所述CYP2C9特异性引物对、VKORC1特异性引物对和CYP2C19特异性引物对中均至少有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列。4.根据权利要求4所述的SNP分型方法，其特征在于，所述CYP2C9特异性引物对、VKORC1特异性引物对和CYP2C19特异性引物对均包括外引物对和内引物对；所述CYP2C9、VKORC1和CYP2C19内引物对中均至少有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列；所述步骤A包括以下步骤:A1、利用CYP2C9、VKORC1和CYP2C19外引物对分别对待测样本进行PCR扩增，得CYP2C9第一次扩增产物、VKORC1第一次扩增产物和CYP2C19第一次扩增产物；A2、分别以CYP2C9第一次扩增产物、VK...

【专利技术属性】
技术研发人员：盛司潼，邓波，
申请(专利权)人：广州康昕瑞基因健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44