一种基因诊断试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术涉及一种与J亚型禽白血病抗性密切相关的基因NRAMP1诊断试剂盒及其使用方法，属于分子生物学技术领域。该试剂盒包括NRAMP1基因PCR扩增的上下游引物混合物，限制性内切酶TscAI和rTaq酶；使用方法以RFLP方法检测NRAMP1基因的基因型，PCR扩增位点所在片段，内切酶TscAI进行酶切反应；NRAMP1外显子C125T突变对J亚型禽白血病的抗性有影响，携带T等位基因的个体为J亚型禽白血病抗性群体，特别是携带T等位基因的公鸡对J亚型禽白血病抗性更强。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术专利属于生物
，利用PCR-RFLP技术检测提供一种对J亚型禽白血病抗性相关基因——NRAMP1(Natural Resistance Associated Macrophage protein)的C125T-SNP分型试剂盒。
技术介绍
NRAMP1基因也称为溶质转运11成员1(Solute carrier family 11 member 1，SLC11A1)。该基因是一个较为保守的基因。MelderD C等研究发现，其与人类、小鼠及畜禽的抗病力相关，主要影响动物的固有免疫(Melder D C et al.,1995))。Hu等克隆分析了鸡的NRAMP1基因，它由554个氨基酸所构成，有15个外显子，含有12个推定的转膜区域及2个糖基化位点，主要是起到离子通道以及转运的功能(Hu et al.,1996)。NRAMP1基因与鸡、老鼠和人类有68％的同源性。经过Northern杂交实验表明：NRAMP1基因主要在网状内皮组织，如脾脏、肝脏、肺和胸腺的吞噬细胞(如巨噬细胞和嗜中性粒细胞及外周血细胞)中表达，这一点与老鼠和人类是一样的(Chery L H et al.,1999)。该基因在哺乳动物的胸腺中不能表达，但在鸡胸腺中的表达量却很高。有研究发现，通过病菌侵染抗性与易感性小鼠，该基因功能丧失的小鼠在感染早期免疫力低下，在感染后期的免疫功能正常(Chery L H et al.,1999)。这表明NRAMP1基因在早期巨噬细胞与病菌互作时可能发挥重要作用。研究发现，该基因与伤寒沙门氏菌、利什曼菌等多种胞内寄生病原菌和某些病毒性疾病的抵抗作用相关。说明NRAMP1基因是决定鸡是否是对J亚型禽白血病易感的一个重要因素，而它作为易感性评价的基础就是其SNP特性。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，是由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列的多态性，包括转换、颠换、插入或缺失。SNP是疾病易感性、显现性、抵抗力、以及药物反应性等生物性状差异的重要基础，很多疾病与基因突变或基因多态有关。SNP作为第三代遗传标记已得到飞速发展，目前已经多种发展成熟的检测技术，如DNA测序(Sanger测序法和焦磷酸测序法)、单链构象多态性(SSCP)、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、等位基因特异的寡聚核苷酸杂交(ASO)、寡聚核苷酸特异的连接、DNA芯片以及Taqman探针等技术手段。经过对现有国内外文献和专利的检索，至今未见有NRAMP1基因多态性位点与J亚型禽白血病抗性相关性的报道。根据以上问题，本专利技术相较于以往传统方式，此位点对于研究鸡NRAMP1基因抗J亚型禽白血病的作用机制具有非常重要的意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是：研究鸡NRAMP1基因抗J亚型禽白血病的作用机制的分析准确性。本专利技术提供以下技术方案：包括：1.一种J亚型禽白血病抗性相关基因——NRAMP1诊断试剂盒，其特征是：包括NRAMP1基因PCR扩增的上下游引物混合物，限制性内切酶TscAI和rTaq酶；NRAMP1基因PCR扩增的上下游引物混合物表示的信息为：上游引物5'-CCCTTGGATATGTGTTTGCAGA-3'下游引物5'-CTGGCTCCAATGATGCCA-3'一种J亚型禽白血病抗性相关基因——NRAMP1诊断试剂盒的方法包括下列步骤：1)PCR扩增SNP位点所在片段；2)PCR产物的酶切鉴定；PCR扩增SNP位点所在片段有以下步骤：1)PCR扩增反应体系准备，在200μl的PCR薄壁管中，加入1μl 50ng/μl DNA模板、2μl10×PCR反应缓冲液、0.8ul2.5mM dNTP、0.8ul 5uM引物P和0.1μl 5U/ul rTaq DNA聚合酶，加水至20ul，充分混匀后短暂离心；2)在PCR仪上设置如下PCR反应程序：先94℃变性4分钟；再经过35个循环，每个循环包括94℃30秒、56℃30秒、72℃30s；然后72℃延伸6分钟、最后4℃保存；PCR反应程序设置完毕后，将PCR薄壁管放入PCR仪进行反应扩增；3)反应结束后，取4μl反应产物在2％琼脂糖胶，1×TBE中电泳，检测扩增产物片段大小，以扩增产物片段为268bp，判定PCR扩增的片段是否正确；PCR产物的酶切鉴定有以下步骤：1)在200μl的PCR薄壁管中加入如下酶切反应体系，5μl PCR产物、1μl 10倍缓冲液、1ul 10U/ul TscAI酶加水至15μl，65℃消化2.5h；2)酶切结果鉴定，全部酶切产物在4％琼脂糖胶，1×TBE中电泳，判定酶切结果，进行基因分型，分型依据为，酶切产物为119bp和101bp两条带则为TT基因型，酶切产物为225bp则为CC基因型，三条带的则为杂合型CT。附图说明图1为本专利技术的结构图；附图说明：1、盒体；2、衬垫；3、上游引物混合物P；4、限制性内切酶；5、DNA Tag酶；6、下游引物混合物P；图2为本专利技术的NRAMP1基因PCR产物扩增检测结果图具体实施方式为了使本专利技术所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行详细的说明。应当说明的是，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术，能实现同样功能的产品属于等同替换和改进，均包含在本专利技术的保护范围之内。具体方法如下：实施例1：在实际中，本试剂盒由1、盒体；2、衬垫；3、上游引物混合物P；4、限制性内切酶；5、DNATag酶；6、下游引物混合物P，其中上下游引物混合物P详细信息如下：上下游引物混合物P表示用于NRAMP1基因PCR扩增的上下游引物混合物，引物信息如下：上游引物5'-CCCTTGGATATGTGTTTGCAGA-3'下游引物5'-CTGGCTCCAATGATGCCA-3'本试剂盒使用方法：1PCR扩增SNP位点所在片段1)PCR扩增反应体系准备PCR的反应体系为20μl，其中包括：模板DNA(约50ng) 1μl扩增缓冲液(10×buffer) 2μl2.5mM dNTP 0.8μl引物P(5uM) 0.8μl5U/ul DNA聚合酶(rTaq) 0.1μl加水补至 20μl在200μl的PCR薄壁管中，按照以上反应体系加入试剂，充分混匀后短暂离心。2)PCR扩增反应程序设置在eppendorfPCR仪上设置如表1所述，程序设置完毕后，将PCR反应管放入PCR仪进行反应扩增。表1 PCR扩增反应程序3)反应结束后，取4μl反应产物在2％琼脂糖胶，1×TBE中电泳，检测反应是否成功。2PCR产物的酶切鉴定1)酶切反应体系15ul，如下PCR产物 5μl10倍缓冲液 1μl10U/ul TscAI(MBI公司) 1ul用水补至 15μl65℃消化 2.5h2)酶切结果检测全部酶切产物在4％琼脂糖胶，1×TBE中电泳，判定酶切结果，进行基因分型。实施例2：运用本试剂盒对100本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基因诊断试剂盒，其特征是：包括NRAMP1基因PCR扩增的上下游引物混合物，限制性内切酶TscAI和rTaq酶；所述NRAMP1基因PCR扩增的上游引物和下游引物的混合物表示的信息为：所述上游引物5'‑CCCTTGGATATGTGTTTGCAGA‑3'所述下游引物5'‑CTGGCTCCAATGATGCCA‑3' 。

【技术特征摘要】
1.一种基因诊断试剂盒，其特征是：包括NRAMP1基因PCR扩增的上下游引物混合物，限制性内切酶TscAI和rTaq酶；所述NRAMP1基因PCR扩增的上游引物和下游引物的混合物表示的信息为：所述上游引物5'-CCCTTGGATATGTGTTTGCAGA-3'所述下游引物5'-CTGGCTCCAATGATGCCA-3' 。2.一种基因诊断试剂盒使用方法，其特征是，所述方法包括下列步骤：1)PCR扩增SNP位点所在片段；2)PCR产物的酶切鉴定。3.根据权利要求2所述基因诊断试剂盒使用方法，其特征是，所述PCR扩增SNP位点所在片段有以下步骤：1)PCR扩增反应体系准备，在200μl的PCR薄壁管中，加入1μl 50ng/μl DNA模板、2μl10×PCR反应缓冲液、0.8ul2.5mM dNTP、0.8ul 5uM引物P和0.1μl 5U/ul rTaq DNA聚合酶，加水至20ul，充分混匀后短暂离心；2)在PCR仪上设置如下...

【专利技术属性】
技术研发人员：王乾，
申请(专利权)人：王乾，
类型：发明
国别省市：安徽;34