细胞系种属鉴定的引物对及其应用制造技术

本发明专利技术公开了细胞系种属鉴定的引物对及其应用，该引物对为引物对1或引物对2或引物对3中的任意一种；所述引物对1由核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的正向引物1F和核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的反向引物1R组成；所述引物对2由核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的正向引物2F和核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的反向引物2R组成；所述引物对3由核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示的正向引物3F和核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示的反向引物3R组成。本发明专利技术引物对可用于细胞系种属和物种种属鉴定中，能降低细胞系种属鉴定或物种鉴定的成本，简化操作，促进细胞系质量监测标准化。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及细胞系种属鉴定技术。
技术介绍
很多生物医药的研究都采用培养细胞来进行，这些细胞可能是从细胞库得来，也可能是受赠于其它研究人员，尤其在中国，目前细胞的传播太复杂、无序，很多都不是通过正规途径获得，如友情赠送等。据统计，约30％细胞系被交叉污染或错误辨识，因使用了交叉污染或错误辨识的细胞而导致研究结论错误、结果不可重复、临床细胞治疗灾难性后果，这浪费大量时间、精力和金钱，还可能造成不可挽回的灾难性后果。因此，近年NIH、ATCC、Nature和Science等对此多次发出呼吁，要求研究者对细胞进行鉴定，如2011年美国国家标准学会专门颁布了一份细胞STR鉴定国家标准；2014年12月、2015年2月Science杂志分别发表文章专题阐述细胞交叉污染和错误辨识严重性；2015年4月Nature通知：Nature旗下杂志将从5月开始要求作者鉴定论文中所用细胞系；2015年6月有报道称一科学家由于用错细胞系，撤销Nature论文。STR(Short TandemRepeat，短串联重复序列)基因分型已被ICLAC、ATCC等权威机构作为金标准应用于细胞鉴定，目前越来越多的杂志要求在投稿时提供细胞STR分型数据。与细胞系STR鉴定一样，细胞系是否存在种属间的交叉污染鉴定也同等重要，美国国家标准研究所(American National Standards Institute，ANSI)公布了一个细胞种属鉴定的标准：ANSI/ATCC ASN-0003-2015，而使用此标准ANSI/ATCC ASN-0003-2015需要收取较高费用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供适用于细胞系种属鉴定的，鉴定准确性高，操作简单的引物对。本专利技术的另一个目的是提供上述引物对在细胞系种属鉴定中的应用。本专利技术的上述目的是通过如下方案予以实现的：本专利技术提供的细胞系种属鉴定的引物对，为引物对1或引物对2或引物对3中的任意一种；所述引物对1由核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的正向引物1F和核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的反向引物1R组成；所述引物对2由核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的正向引物2F和核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的反向引物2R组成；所述引物对3由核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示的正向引物3F和核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示的反向引物3R组成。本专利技术人用引物对1分别扩增人、大鼠、小鼠、兔、狗、猪和猴的基因序列，结果显示测得序列与对应基因组序列的同源性都在99％以上，且不同种属测得序列之间的差异性明显，说明引物对1确实可以实现细胞系种属的准确鉴定；该引物对1在进行细胞系种属鉴定时候，PCR所用的变性温度和时间，退火温度和时间以及延伸温度和时间可根据具体待测基因组来进行调整，本专利技术推荐引物对1的PCR反应条件为：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸42s。本专利技术人用引物对2分别扩增人、大鼠、小鼠、兔、狗、猪和猴的基因序列，结果显示测得序列与对应基因组序列的同源性都在99％以上，且不同种属测得序列之间的差异性明显，说明引物对2确实可以实现细胞系种属的准确鉴定；该引物对2在进行细胞系种属鉴定时候，PCR所用的变性温度和时间，退火温度和时间以及延伸温度和时间可根据具体待测基因组来进行调整，本专利技术推荐引物对2的PCR反应条件为：94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸42s。本专利技术人用引物对3分别扩增人、大鼠、小鼠、兔、狗、猪和猴的基因序列，结果显示测得序列与对应基因组序列的同源性都在99％以上，且不同种属测得序列之间的差异性明显，说明引物对3确实可以实现细胞系种属的准确鉴定；该引物对3在进行细胞系种属鉴定时候，PCR所用的变性温度和时间，退火温度和时间以及延伸温度和时间可根据具体待测基因组来进行调整，本专利技术推荐引物对3的PCR反应条件为：94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸72s。本专利技术的引物对1或引物对2或引物对3可应用于细胞系种属鉴定，从而加速细胞质量监测的标准化；也可以作为辅助手段，用于细胞系种属鉴定。本专利技术的引物对1或引物对2或引物对3可应用于物种种属鉴定。本专利技术的引物1或引物对2或引物对3可以制备成试剂盒，用于细胞系种属鉴定或物种鉴定。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：1.现有技术中尚未有一对引物可以同时扩增人、大鼠、小鼠、兔、狗、猪和猴的基因序列；本专利技术采用生物信息技术优势开发出能用于多个物种鉴定的3对引物对，这3对引物对每1对引物都可以扩增出人、大鼠、小鼠、兔、狗、猪和猴这7个物种的目的片段，且同一对引物扩增出的序列各物种间差异性明显；2.本专利技术引物对的应用可大大降低了细胞系种属鉴定或物种鉴定的成本，而且大大简化了细胞系种属鉴定或物种鉴定的操作，促进了细胞系质量监测标准化。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步地描述，但具体实施例并不对本专利技术做任何限定。实施例1引物对的获得1、基因组来源人(human)、狗(dog)、猪(pig)、兔(rabbit)、大鼠(rat)、小鼠(mouse)和恒河猴(rhesus)这7个物种的基因组数据是从Genebank上下载的该物种最新版本的基因组，具体基因组数据来源如表1所示。表1基因组数据来源2、基因组DNA本专利技术人委托泰因生物科技有限公司实验室用TAKARA公司的基因组总DNA提取试剂盒提取获得人(human)、狗(dog)、猪(pig)、兔(rabbit)、大鼠(rat)、小鼠(mouse)和恒河猴(rhesus)的基因组DNA。3、目标序列筛选本专利技术人采用lastz作为比对软件来比对和分析人(human)、狗(dog)、猪(pig)、兔(rabbit)、大鼠(rat)、小鼠(mouse)和恒河猴(rhesus)的基因组，然后通过linux运行比对程序。以兔和狗的基因组比对为例，其比对参数如表2所示。表2 lastz比对参数基因组比对总共得到6个比对结果文件，分别为兔与人、大鼠、小鼠、狗、猪、恒河猴的比对结果。由于6个物种都是以兔的基因组做为参考序列来进行的比对，所以可以得到每个物种和兔基因组的同源区域。根据这6个物种和兔同源区域的重叠，进而筛选出人、大鼠、小鼠、狗、猪、恒河猴和兔这7个物种同源的区域以及基因组序列，总共筛选出7个物种共有的同源性大于70％且小于100％，同源区域长度大于200bp的序列57620组。由于设计引物需要连续相同的序列超过18bp，因此，对上述57620组序列进行进一步地过滤，过滤掉完全连续同源区域小于17bp且完全同源区域个数小于2个的序列区域，得到了可以用来设计引物的873组同源序列。为了保证序列可以区分出物种的差异，选取物种间差异度较大的序列来设计PCR引物。4、引物设计目标片段筛选完成后，利用引物设计软件Priemer 5.0进行引物设计。引物设计的要求是：选取能够完全涵盖目标片段的引物，引物长度在18～24bp之间，退火温度52℃～60℃。则最终设计得到3对引物，分别是引物对1、引物对2和引物对3；所述引物对1由核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的正向引物1F和核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的反向本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细胞系种属鉴定的引物对，其特征在于该引物对为引物对1或引物对2或引物对3中的任意一种；所述引物对1由核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的正向引物1F和核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的反向引物1R组成；所述引物对2由核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的正向引物2F和核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的反向引物2R组成；所述引物对3由核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示的正向引物3F和核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示的反向引物3R组成。

【技术特征摘要】
1.一种细胞系种属鉴定的引物对，其特征在于该引物对为引物对1或引物对2或引物对3中的任意一种；所述引物对1由核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的正向引物1F和核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的反向引物1R组成；所述引物对2由核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的正向引物2F和核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的反向引物2R组成；所述引物对3由核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示的正向引物3F和核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示的反向引物3R组成。2.根据权利要求1所述引物对，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜红丽，蒙裕欢，
申请(专利权)人：广州泰因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44