用于诊断PAH基因突变的杂交膜条、PCR引物及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开一种用于诊断PAH基因突变的杂交膜条、PCR引物及试剂盒，所述杂交膜条包括基底，以及固定在所述基底上的突变检测探针，每一条所述突变检测探针分别对应包含一个PAH基因突变位点，所述PAH基因突变位点包括以下位点：R111X、R176X、EX6‑96A>G、R241C、R243Q、R252Q、Y356X、V399V和R413P；每一条所述突变检测探针包含15‑25个碱基的序列，在序列的中部位置包含其相对应的PAH基因突变位点的突变碱基；突变检测探针为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.9所示的序列或其反向互补序列的DNA。本发明专利技术具有高通量、高效率、价格低廉、使用方便等优点，有利于实现临床快速检测和大规模人群筛查。

Hybridization film strip, PCR primer and kit for diagnosing PAH gene mutation

The invention discloses a hybrid membrane for the diagnosis of PAH gene mutation, PCR primer and kit, the hybrid membrane strip includes a substrate, and a fixed mutation detection probe on the substrate, each of the corresponding mutation detection probe contains a PAH gene mutation, the mutation of PAH gene site includes the following sites: R111X, R176X, EX6, G, 96A> R241C, R243Q, R252Q, Y356X, V399V and R413P; each of the mutant sequence detection probe contains 15 25 bases, including mutations in PAH gene and its corresponding mutations in the central position of the sequence; mutation detection the probe is SEQ ID NO.1 ~ SEQ ID NO.9 sequence shown or its reverse complementary sequence DNA. The invention has the advantages of high throughput, high efficiency, low price, convenient use, etc., and is favorable for rapid clinical detection and mass population screening.

【技术实现步骤摘要】
用于诊断PAH基因突变的杂交膜条、PCR引物及试剂盒
本专利技术涉及分子生物学检测，特别涉及一种用于诊断苯丙氨酸羟化酶(phenylalaninehydroxylase，PAH)基因突变的杂交膜条及用于扩增待检样品基因片段的聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，缩略词为PCR)引物和用于诊断PAH基因突变的试剂盒。
技术介绍
苯丙酮尿症(phenylketonuria，PKU)是严重威胁人类健康的一种常染色体隐性遗传性苯丙氨酸代谢异常病，绝大部分(98％-99％)是由苯丙氨酸羟化酶(phenylalaninehydroxylase，PAH)基因缺陷所致，使得PAH活性下降或缺乏，导致苯丙氨酸不能正常代谢，血液、组织中的丙氨酸及其旁路代谢产物堆积，最终导致中枢神经系统受到不可逆的损害，而出现精神行为异常、癫痫和智力低下等症状。许多研究显示PAH基因突变表现为高度遗传异质性，在不同的民族和人种之间存在较大的差异。我国的平均发病率为1/11188。苯丙酮尿症可以通过饮食控制治疗，一般需终身采用无(低)苯丙氨酸饮食疗法，早发现早治疗是其治疗的关键，但是昂贵的治疗费用给家庭和社会带来了沉重的经济负担，而且不能从根本上降低PKU患儿的出生率。因此在出生前对胎儿进行诊断，预防患儿出生，能够减少社会和家庭的负担，提高人口素质，具有较高的临床应用价值。造成苯丙酮尿症的原因一般为遗传因素。苯丙酮尿症绝大部分由PAH基因突变引起，国际上报道的PAH基因突变有500多种，但其中有61.5％是错义突变，13.5％是缺失突变，11.5％是剪切突变，其它还有插入、沉默等多种突变形式。不同种族和地区人群之间PAH基因突变位点及分布具有较大差异。如欧洲最常见的是R408W，IVS10-11G->A，IVS12+1G->A。俄罗斯远东地区PKU患者，发现R408W占63％。通过对古巴的28例PKU病人的检测，发现古巴PKU患者的突变热点为E208K(19.3％)和R261Q(15.8％)。对意大利PKU患者的分析，发现IVS10n-t11G>A(19.4％)和R261Q(13.5％)是意大利PKU患者的突变热点。国际PAH基因研究协作组报道东方黄种人(日本、韩国、中国)的高频突变位点是位于第12外显子的R413P(25％)和位于第7外显子的R243Q(18％)。这为我们大规模有针对性的开展PAH基因突变筛查及诊断提供了理论依据。目前，传统基因诊断方法包括酶切，限制性片段长度多态性分析(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)，直接测序等，这些方法或者不能定性，或者耗时费力、所需设备和耗材昂贵，更重要的是这些方法难以同时对多个基因突变位点进行检测。而基因芯片法虽然能同时对不同基因位点进行检测，但它所需设备和耗材昂贵，不适用于在临床大规模推广，应用受到限制。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：弥补上述现有技术的不足，提出一种用于诊断PAH基因突变的杂交膜条、一种用于扩增待检样品基因片段的PCR引物，以及一种用于诊断PAH基因突变的试剂盒。本专利技术采用以下技术方案：一种用于诊断PAH基因突变的杂交膜条，包括基底，以及固定在所述基底上的突变检测探针，每一条所述突变检测探针分别对应包含一个PAH基因突变位点，所述PAH基因突变位点包括以下位点：R111X、R176X、EX6-96A>G、R241C、R243Q、R252Q、Y356X、V399V和R413P；每一条所述突变检测探针包含15-25个碱基的序列，在所述序列的中部位置包含其相对应的PAH基因突变位点的突变碱基；所述突变检测探针为SEQIDNO.1～SEQIDNO.9所示的序列或其反向互补序列的DNA。优选的，还包括分别与每一条所述突变检测探针对应的正常对照探针，所述正常对照探针固定在所述基底上的与所述突变检测探针不同的位置上。优选的，所述正常对照探针为SEQIDNO.10～SEQIDNO.18所示的序列或其反向互补序列的DNA。优选的，所述突变检测探针的3’或5’端带有氨基标记。优选的，所述正常对照探针的3’或5’端带有氨基标记。一种用于扩增待检样品基因片段的PCR引物，所述PCR引物的扩增产物含所述的PAH基因突变位点，所述PCR引物为以下5对：SEQIDNO.19和SEQIDNO.20；SEQIDNO.21和SEQIDNO.22；SEQIDNO.23和SEQIDNO.24；SEQIDNO.25和SEQIDNO.26；SEQIDNO.27和SEQIDNO.28；其中SEQIDNO.19、SEQIDNO.21、SEQIDNO.23、SEQIDNO.25、SEQIDNO.27是上游引物；SEQIDNO.20、SEQIDNO.22、SEQIDNO.24、SEQIDNO.26、SEQIDNO.28是下游引物。优选地，所述扩增产物分别包括如下位点：引物SEQIDNO.19和SEQIDNO.20的扩增产物包含R111X位点，引物SEQIDNO.21和SEQIDNO.22的扩增产物包含R176X、EX6-96A>G位点，引物SEQIDNO.23和SEQIDNO.24的扩增产物包含R241C、R243Q、R252Q位点，引物SEQIDNO.25和SEQIDNO.26的扩增产物包含Y356X、V399V位点，引物SEQIDNO.27和SEQIDNO.28的扩增产物包含R413P位点。优选地，所述上游引物和/或下游引物的5’端带有生物素或荧光标记。一种用于诊断PAH基因突变的试剂盒，其包含所述的用于诊断PAH基因突变的杂交膜条，以及含有所述的用于扩增待检样品基因片段的PCR引物的PCR反应液。本专利技术与现有技术对比的有益效果是：本专利技术是基于PCR-膜条杂交技术的基因检测方法，能同时对多个不同基因突变位点进行检测，由于固定在基底上的突变检测探针的大致中间位置包含有PAH基因的基因突变位点，通过PCR-膜条杂交技术能直接对待检者的基因型进行确诊，对正常、突变杂合子、突变纯合子等很容易判断，具有高通量、高效率、价格低廉、使用方便等优点，有利于实现临床快速检测和大规模人群筛查。附图说明图1是本专利技术实施例的未检出PAH基因突变样品结果示例；图2是本专利技术实施例的PAH基因突变杂合子样品结果示例；图3是本专利技术实施例的PAH基因突变纯合子样品结果示例；图4是本专利技术实施例的PAH基因突变双重杂合子样品结果示例。具体实施方式下面对照附图和结合优选具体实施方式对本专利技术进行详细的阐述。1、杂交膜条的制备1.1、9条突变检测探针和9条正常对照探针的制备按照表1和表2中的序列合成18条探针，突变检测探针和/或正常对照探针的3’或5’端带氨基标记，合成的方法为现有的常规的DNA合成法。表1：表2：注：表1和表2中的“M”代表突变检测探针，“N”代表正常对照探针。突变检测探针SEQIDNO.1～SEQIDNO.9分别对应包含一个如下所示的PAH基因突变位点：R111X、R176X、EX6-96A>G、R241C、R243Q、R252Q、Y356X、V399V、R413P，每一条突变检测探针包含15-25个碱基的序列，在序本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于诊断PAH基因突变的杂交膜条，其特征在于：包括基底，以及固定在所述基底上的突变检测探针，每一条所述突变检测探针分别对应包含一个PAH基因突变位点，所述PAH基因突变位点包括以下位点：R111X、R176X、EX6‑96A>G、R241C、R243Q、R252Q、Y356X、V399V和R413P；每一条所述突变检测探针包含15‑25个碱基的序列，在所述序列的中部位置包含其相对应的PAH基因突变位点的突变碱基；所述突变检测探针为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.9所示的序列或其反向互补序列的DNA。

【技术特征摘要】
1.一种用于诊断PAH基因突变的杂交膜条，其特征在于：包括基底，以及固定在所述基底上的突变检测探针，每一条所述突变检测探针分别对应包含一个PAH基因突变位点，所述PAH基因突变位点包括以下位点：R111X、R176X、EX6-96A>G、R241C、R243Q、R252Q、Y356X、V399V和R413P；每一条所述突变检测探针包含15-25个碱基的序列，在所述序列的中部位置包含其相对应的PAH基因突变位点的突变碱基；所述突变检测探针为SEQIDNO.1～SEQIDNO.9所示的序列或其反向互补序列的DNA。2.根据权利要求1所述的杂交膜条，其特征在于：还包括分别与每一条所述突变检测探针对应的正常对照探针，所述正常对照探针固定在所述基底上的与所述突变检测探针不同的位置上。3.根据权利要求2所述的杂交膜条，其特征在于：所述正常对照探针为SEQIDNO.10～SEQIDNO.18所示的序列或其反向互补序列的DNA。4.根据权利要求1-3任意一项所述的杂交膜条，其特征在于：所述突变检测探针的3’或5’端带有氨基标记。5.根据权利要求2-3任意一项所述的杂交膜条，其特征在于：所述正常对照探针的3’或5’端带有氨基标记。6.一种用于扩增待检样品基因片段的PCR引物，其特征在于：所述PCR引物的扩增产物含权利要求1所述的PAH基因突变位点，所述PCR引物为以下5对：SEQIDNO.19和SEQIDNO.20；SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖生赟，冯传欣，李川，
申请(专利权)人：深圳市亿立方生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44