用于预测乳腺癌的生物标记物组合、试剂盒及使用方法技术

本发明专利技术提供用于预测乳腺癌的生物标记物组合、试剂盒，引物设计基因选自乳腺癌组织和正常组织中甲基化率差异最显著的四种端粒基因。根据四种端粒基因的启动子区和编码区分别设计目标基因的甲基化引物和qPCR引物，形成甲基化引物组合和qPCR引物组合。本发明专利技术提供的生物标记物组合根据乳腺癌组织和正常组织中甲基化率差异最显著的端粒基因设计，在检测样本是否为乳腺癌时，生物标记物组合能够特异性地捕获和扩增检测样本中的特定DNA片段，提高检测灵敏度，具有较好的抗噪性、灵活性和准确度，能够用于乳腺癌早期预测、治疗用药评估检测和预后复发检测。本发明专利技术提供的用于预测乳腺癌的方法操作快速、方法简便，具有较好的可行性与预测效果。

Biomarker combinations for predicting breast cancer, kits and methods of use

The present invention provides a biomarker combination, a kit for predicting breast cancer, and a primer designed for four genes that are differentially selected from breast cancer tissues and normal tissues with the highest methylation rates. Based on the promoter region and coding region of four telomere genes, the methylation primers and qPCR primers of target gene were designed to form the methylation primer combination and qPCR primer combination. Telomere gene biomarker combination provided by the invention according to methyl breast cancer and normal tissue was the most significant difference in the detection, whether the sample for breast cancer, combinations of biomarkers can specifically capture and amplification of specific DNA fragment in the test sample, improve the detection sensitivity, has good anti noise flexibility and accuracy, can be used for early breast cancer prediction, treatment and prognosis evaluation of detection of recurrence detection. The method for predicting breast cancer provided by the invention has the advantages of fast operation, simple method and good feasibility and prediction effect.

【技术实现步骤摘要】
用于预测乳腺癌的生物标记物组合、试剂盒及使用方法
本专利技术涉及生物检测
，尤其涉及用于预测乳腺癌的生物标记物组合、试剂盒及使用方法。
技术介绍
随着当今社会的发展，恶性肿瘤已成为目前人类的主要杀手之一。而对于女性恶性肿瘤，由于乳腺癌是世界范围内造成妇女发病和死亡的重要原因，因而乳腺癌在女性恶性肿瘤中居于首位。大量研究表明，乳腺癌发病的原因大多是环境因素和遗传因素共同作用的结果，而遗传性乳腺癌在所有发病的乳腺癌中仅占有5-10％，因此，大多数乳腺癌无法通过乳腺癌易感基因的突变检测来确定是否发生乳腺癌病变。最近研究发现，DNA(deoxyribonucleicacid，脱氧核糖核酸)甲基化状态与乳腺癌的发生发展密切相关。DNA甲基化主要出现在DNA链鸟嘌呤前的胞嘧啶(即CpG位点)，CpG位点在甲基转移酶的催化作用下添加甲基，CpG位点被甲基化，即DNA甲基化。当DNA甲基化达到一定程度时，常规的右手双螺旋型B-DNA向左手双螺旋型Z-DNA发生过渡。相对于B-DNA，Z-DNA的结构收缩、螺旋加深，这使得许多能够与蛋白质结合的原件缩入螺旋沟内，导致DNA转录起始困难，从而使得基因无法正常表达，即基因失活。人体存在的抑癌基因、致癌基因、DNA修复基因以及细胞周期调节基因等众多基因中都含有CpG位点，当抑癌基因中的CpG位点高度甲基化时，抑癌基因的基因表达被抑制，抑癌基因失活，进而导致抑癌基因丧失正常的抑癌功能；当致癌基因中的CpG位点甲基化比率较低时，致癌基因表达活跃，癌细胞的表达量增加，当癌细胞的表达量增加到一定程度时则发生癌变。同时，人体中还存在与甲基转移酶的作用相反的去甲基酶，通过去甲基酶和甲基转移酶的作用能够使DNA甲基化状态呈现可逆状态，因此，基因中DNA的甲基化水平或甲基化率能够作为衡量癌变的指标。另外，去甲基酶和甲基转移酶的含量会因为生活环境、饮食、药物等方式的不同而不同，因而能够通过改变生活环境、饮食、药物等来避免和减缓乳腺癌的发生发展。生物标记物是一种能够反映细胞生长增殖特性的标志物，能够在生物体受到严重损害之前，从分子、细胞等生物学水平上反应人体的异常化，这种异常化主要表现在生化代谢过程中的变化、异常代谢产物含量以及生理活性物质的异常表现等，因此，通过检测生物标记物能够得知人体当前所处的状态。生物标记物能够标记特定的基因，如与乳腺癌相关的抑癌基因、致癌基因以及DNA修复基因等，以反映出当前机体是否癌变。目前，DNA甲基化与乳腺癌的研究大多集中在单一基因的研究，因而生物标记物也为单一生物标记物。由于乳腺癌肿瘤在分裂生长的过程中，子细胞会出现基因方面的改变，使得乳腺癌肿瘤的生长速度、侵袭能力、治疗以及预后方面产生差异，即乳腺癌肿瘤存在异质性和复杂性，因而基因的突变以及复杂性使得单一生物标记物不能准确指示DNA的甲基化状态和甲基化率，进而单一基因的研究也就不能准确地表明DNA甲基化与乳腺癌的关系。另外，单一生物标记物在应用时存在较为严重的假阳性和假阴性问题，且检测灵敏度低，这使得检测结果的准确度降低。
技术实现思路
本专利技术提供一种用于预测乳腺癌的生物标记物组合、试剂盒及使用方法，以解决现有生物标记物在指示DNA的甲基化状态和甲基化率时灵敏度低、准确度低的问题。第一方面，本专利技术提供一种用于预测乳腺癌的生物标记物组合，所述组合为甲基化引物组合，所述甲基化引物组合包括：根据端粒基因RAD50设计的序列为TTATATGTTATGTGATTATTGGAAATTAT的正向引物和序列为TTCCCAAAACTTAATCCTAAAACTC的反向引物；根据端粒基因RTEL设计的序列为GGGTTGGGTGTTAGTGAGTGT的正向引物和序列为CAACTCCCATACCCCAAAAA的反向引物；根据端粒基因TERC设计的序列为AAAATTTGTAGAGTAGGAATTAAGTTG的正向引物和序列为CCCCAAACCTAACTAACTAAAC的反向引物；和/或，根据端粒基因TRF1设计的序列为TAGTAGAATAGGAATTTTGGGAGT的正向引物和序列为AATACAACCTTAACTAAAAC的反向引物。第二方面，所述试剂盒包括甲基化引物组合。第三方面，本专利技术提供一种用于检测DNA样品中DNA片段的目标基因位置的甲基化率的方法，所述方法包括：DNA样本经亚硫酸盐处理后采用甲基化引物组合分别靶向PCR扩增，得到包含测序Tag序列的靶向PCR扩增产物；向所述包含测序Tag序列的靶向PCR扩增产物中插入上游通用测序引物和下游带条形码的测序引物，以区别不同样本的靶向PCR扩增产物；其中，相同样本的所述靶向PCR扩增产物插入上游通用测序引物和条形码相同的所述下游带条形码的测序引物，不同样本的所述靶向PCR扩增产物插入上游通用测序引物和条形码不同的所述带条形码的下游测序引物；所述反应体系分别PCR扩增，得到不同样本的PCR扩增产物；将不同样本的所述PCR扩增产物等比例混合构成扩增子文库；所述扩增子文库经纯化、定量和质控后得到甲基化测序文库；对所述甲基化测序文库双端测序、样本拆分和甲基化信息分析，得到各样本DNA中目的基因各CpG位点的甲基化状态和甲基化率。结合第三方面，所述靶向PCR扩增的扩增条件为：95℃保持10分钟，95℃变性保持15秒，58℃退火保持30秒，72℃延伸保持60秒，共40个循环；所述PCR扩增的扩增条件为：95℃保持10分钟，95℃变性保持15秒，60℃退火保持30秒，72℃延伸保持60秒，共15个循环，循环结束后在72℃下延伸反应3分钟。第四方面，本专利技术提供一种用于预测乳腺癌的生物标记物组合，所述组合为qPCR引物组合，所述qPCR引物组合包括：根据端粒基因RAD50设计的序列为TGGATATGCGAGGACGATG的正向引物和序列为TGTTGGCTCATCCAAGGCA的反向引物；根据端粒基因RTEL设计的序列为CATCGATGCTGTTGAGCTGC的正向引物和序列为GGATGATCTGGTCCAGCGAG的反向引物；根据端粒基因TERC设计的序列为CATGTGTGAGCCGAGTCCTG的正向引物和序列为GAAGAGGAACGGAGCGAGTC的反向引物；根据端粒基因TRF1设计的序列为GTCTGCGGTAACTGAATCCTCA的正向引物和序列为TTGTTGCTGGGTTCCATGTT的反向引物；和/或，根据参考基因GAPDH设计的序列为CCTCTCCCCAGCCAAAGAAG的正向引物和序列为TGACCCTTTTTGGACTTCAG的反向引物。第五方面，本专利技术提供一种用于预测乳腺癌的试剂盒，所述试剂盒包括qPCR引物组合。第六方面，本专利技术提供一种用于预测乳腺癌的生物标记物组合，所述组合包括甲基化引物组合和qPCR引物组合。第七方面，本专利技术提供一种用于预测乳腺癌的试剂盒，所述试剂盒包括包含有甲基化引物组合和qPCR引物组合的生物标记物组合。第八方面，本专利技术提供一种用于检测核酸样品中目标基因位置的目标基因甲基化率和目标基因表达量的方法，采用包含有甲基化引物组合和qPCR引物组合的生物标记物组合，其中，甲基化引物组合用于检测目的基因的甲基化率，qPCR引物组合用于检测目的基因的表达量本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于预测乳腺癌的生物标记物组合，其特征在于，所述组合为甲基化引物组合，所述甲基化引物组合包括：根据端粒基因RAD50设计的序列为TTATATGTTATGTGATTATTGGAAATTAT的正向引物和序列为TTCCCAAAACTTAATCCTAAAACTC的反向引物；根据端粒基因RTEL设计的序列为GGGTTGGGTGTTAGTGAGTGT的正向引物和序列为CAACTCCCATACCCCAAAAA的反向引物；根据端粒基因TERC设计的序列为AAAATTTGTAGAGTAGGAATTAAGTTG的正向引物和序列为CCCCAAACCTAACTAACTAAAC的反向引物；和/或，根据端粒基因TRF1设计的序列为TAGTAGAATAGGAATTTTGGGAGT的正向引物和序列为AATACAACCTTAACTAAAAC的反向引物。

【技术特征摘要】
1.一种用于预测乳腺癌的生物标记物组合，其特征在于，所述组合为甲基化引物组合，所述甲基化引物组合包括：根据端粒基因RAD50设计的序列为TTATATGTTATGTGATTATTGGAAATTAT的正向引物和序列为TTCCCAAAACTTAATCCTAAAACTC的反向引物；根据端粒基因RTEL设计的序列为GGGTTGGGTGTTAGTGAGTGT的正向引物和序列为CAACTCCCATACCCCAAAAA的反向引物；根据端粒基因TERC设计的序列为AAAATTTGTAGAGTAGGAATTAAGTTG的正向引物和序列为CCCCAAACCTAACTAACTAAAC的反向引物；和/或，根据端粒基因TRF1设计的序列为TAGTAGAATAGGAATTTTGGGAGT的正向引物和序列为AATACAACCTTAACTAAAAC的反向引物。2.一种用于预测乳腺癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的甲基化引物组合。3.一种用于检测DNA样品中DNA片段的目标基因位置的甲基化率的方法，其特征在于，所述方法包括：DNA样本经亚硫酸盐处理后采用如权利要求1所示的甲基化引物组合分别靶向PCR扩增，得到包含测序Tag序列的靶向PCR扩增产物；向所述包含测序Tag序列的靶向PCR扩增产物中插入上游通用测序引物和下游带条形码的测序引物，以区别不同样本的靶向PCR扩增产物；其中，相同样本的所述靶向PCR扩增产物插入所述上游通用测序引物和条形码相同的所述下游带条形码的测序引物，不同样本的所述靶向PCR扩增产物插入所述上游通用测序引物和条形码不同的所述下游带条形码的测序引物；所述反应体系分别PCR扩增，得到不同样本的PCR扩增产物；将不同样本的所述PCR扩增产物等比例混合构成扩增子文库；所述扩增子文库经纯化、定量和质控后得到甲基化测序文库；对所述甲基化测序文库双端测序、样本拆分和甲基化信息分析，得到各样本DNA中目的基因各CpG位点的甲基化状态和甲基化率。4.根据权利要求3所述的用于检测DNA样品中DNA片段的目标基因位置的甲基化率的方法，其特征在于，所述靶向PCR...

【专利技术属性】
技术研发人员：王军，郭鑫武，彭厘旻，戴立忠，
申请(专利权)人：湖南圣维基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南,43