【技术实现步骤摘要】
基于磁性分离和量子点标记的人A群链球菌快速检测方法和试剂盒
本专利技术涉及医学检测
,具体为一种基于磁性分离和量子点标记的检测人A群链球菌(groupAstreptococci,GAS)(M1,3,5,6,24血清型)抗原的快速检测方法及检测试剂盒,以及该检测试剂盒的制备及使用方法。
技术介绍
链球菌广泛分布于自然界和动物体内,可长期寄居于人体鼻咽部和肠道中。为革兰氏阳性菌,呈球状或卵圆形,为需氧或兼性厌氧菌,对营养要求较高。链球菌种类繁多,根据溶血能力分为α、β、γ溶血性链球菌,又称之甲型、乙型、丙型溶血性链球菌。根据链球菌胞壁所含多糖(C抗原)的不同分为A~V等20族(其中缺I和J),(Lancefield分型)。对人类有致病性的链球菌90%属于A群。链球菌C抗原的外层还具有M、T、R、S4种型特异性抗原。M抗原主要见于A群,根据M抗原的不同又可分为90多个血清型,其中在我国能引起风湿热的临床上最常见的血清型为M1,M3,M5,M6,M18,M24等。A群链球菌(groupAstreptococci,GAS)又称化脓性链球菌(streptococcuspyogenes),为β溶血性链球菌。A群链球菌感染和后遗症一直是困扰公共健康和国民经济的严重问题,尤对儿童和青年影响最大。A群链球菌感染最常发生于冬春季和雨季,在儿童发病年龄多见于5~15岁,临床可把A群链球菌感染分为四类:①浅表部位感染:咽炎、皮肤和软组织感染、脓疱疮、丹毒、阴道炎、产后感染;②深部感染:菌血症、坏死性筋膜炎、深部组织感染、蜂窝织炎、肌炎、脓毒败血症、心包炎、脑膜炎、肺炎、化脓性 ...
【技术保护点】
一种基于磁性分离和量子点标记的检测人A群链球菌抗原的方法,其特征在于:所述方法包括以下步骤:1)兔抗人A群链球菌1,3,5,6,24型M蛋白多克隆抗体的制备;2)鼠抗人A群链球菌1,3,5,6,24型M蛋白多克隆抗体的制备;3)将步骤1)制备得到的兔抗人A群链球菌1,3,5,6,24型M蛋白多克隆抗体与纳米磁珠通过共价偶联,制备抗人A群链球菌免疫纳米磁珠;4)将步骤2)制备得到的鼠抗人A群链球菌1,3,5,6,24型M蛋白多克隆抗体与纳米量子点通过共价偶联,制备量子点标记的抗人A群链球菌纳米探针;5)取人呼吸道分泌物样本,用PBST缓冲液溶解后,加入步骤3)制备得到的抗人A群链球菌免疫纳米磁珠,充分混合,反应10‑45min后进行磁分离,以PBST缓冲液洗涤2遍后,向磁分离得到的沉淀物中加入步骤4)制备得到的量子点标记的抗人A群链球菌纳米探针,反应10‑45min后进行磁分离,以PBST缓冲液洗涤2遍后,使用荧光酶标仪读取荧光值;所述PBST缓冲液中各组分含量如下:8g/LNaCL,0.2g/L KCl,0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HPO4,0.3g/L NaN ...
【技术特征摘要】
1.一种用于制备基于磁性分离和量子点标记的检测人A群链球菌抗原的试剂盒的方法,其特征在于:所述制备方法包括以下步骤:1)抗人A群链球菌免疫纳米磁珠的制备:1.1)兔及鼠抗人A群链球菌1,3,5,6,24型M蛋白多克隆抗体IgG的制备1.1.1)重组M-His融合蛋白的制备、纯化:1.1.1.1)对人A群链球菌1,3,5,6,24型M蛋白进行生物信息学分析,分别获取其N端型特异性序列中含胞外抗原表位且不与其他抗原抗体起交叉反应的的肽段;1.1.1.2)找到步骤1.1.1.1)中所得到五个肽段一一对应的基因编码序列,按M1-M3-M5-M6-M24的顺序进行序列拼接并根据大肠杆菌中密码子的偏好性对该序列进行密码子优化,在上述经密码子优化后的重组基因的序列的5’端及3’端引入酶切位点并化学合成全基因序列,同时标记记为m;1.1.1.3)将步骤1.1.1.2)中所得到的m按分子生物学方法克隆入表达载体pET-28a(+)后转入大肠杆菌中表达重组M-His融合蛋白;所述重组M-His融合蛋白以可溶性表达方式存在于菌体中;1.1.1.4)用镍柱纯化步骤1.1.1.3)所得到的重组蛋白,SDS-PAGE检测其纯度后,以Bradford法测定蛋白质浓度,调整蛋白浓度为0.2mg/mL后备用;1.1.2)兔及鼠抗人A群链球菌1,3,5,6,24型M蛋白多克隆抗体IgG的制备:1.1.2.1)以步骤1.1.1.4)中所得到的重组M-His融合蛋白为完全抗原,分别免疫新西兰大白兔及豚鼠;分别制备兔抗人A群链球菌1,3,5,6,24型M蛋白抗血清及鼠抗人A群链球菌1,3,5,6,24型M蛋白抗血清;所述兔抗人A群链球菌1,3,5,6,24型M蛋白抗血清及鼠抗人A群链球菌1,3,5,6,24型M蛋白抗血清的间接ELISA效价均大于1×105;所述间接ELISA是重组M-His融合蛋白作为包被抗原为基础;1.1.2.2)采用ProteinG亲和层析柱分别纯化兔抗人A群链球菌1,3,5,6,24型M蛋白抗血清及鼠抗人A群链球菌1,3,5,6,24型M蛋白抗血清中的多克隆抗体IgG;1.1.2.3)用凯基Bradford蛋白含量检测试剂盒测定步骤1.1.2.2)所得到的多克隆抗体IgG的浓度,将其蛋白浓度均调整为1mg/mL后备用;1.2)免疫纳米磁珠的包被:1.2.1)取5mg磁珠,用1mlMES缓冲液洗涤三次,置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除上清;所述磁珠是以超顺磁性Fe3O4为内核、粒径为350nm的羧基磁珠;所述MES缓冲液是质量浓度是2g/L的2-(N-吗啉代)乙磺酸;所述MES缓冲液的pH=6.0;所述纳米磁分离器的磁性强度是0.4T;1.2.2)依次加入用步骤1.2.1)中的MES缓冲液配制的浓度是8-12mg/ml的EDC溶液以及用步骤1.2.1)中的MES缓冲液配制的浓度是6-12mg/ml的sulfo-NHS溶液各0.5ml,以10-40rpm于旋转混合仪中活化1hr,置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除上清,用1ml步骤1.2.1)中的MES缓冲液重悬,得到活化后的磁珠;1.2.3)取5个离心管,在每个离心管中加入200μL步骤1.2.2)所得到的活化后的磁珠,置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除上清,向各离心管中加入用PBS缓冲液稀释的浓度为50-300μg/ml的由步骤1.1)所制备的兔抗人A群链球菌1,3,5,6,24型M蛋白多克隆抗体IgG溶液各1ml,室温下以15rpm于旋转混合仪中反应2-6h,置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除上清后,各加入1ml含1mg/ml乙醇胺的上述PBS缓冲液,室温下以15rpm于旋转混合仪中反应2h以封闭磁珠上未与抗体反应的羧基;所述PBS缓冲液中各成分含量如下:8g/LNaCl,0.2g/LKCl,0.24g/LKH2PO4,1.44g/LNa2HPO4,所述PBS缓冲液的pH=7.4;1.2.4)封闭反应完成后,将该5个离心管置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除上清,各用1ml洗涤缓冲液洗涤三遍;所述洗涤缓冲液中各成分含量如下:8g/LNaCl,0.2g/LKCl,0.24g/LKH2PO4,1.44g/LNa2HPO4,0.5ml...
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