人肺炎链球菌量子点免疫层析检测卡及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种人肺炎链球菌量子点免疫层析检测卡及其制备方法和应用，该检测卡包括底板、样品垫、吸水垫、结合垫和检测层；结合垫包被有量子点标记的抗人肺炎链球菌纳米探针；检测层是由带有一条检测线以及一条质控线的固相硝酸纤维素膜构成；检测线包被有鼠抗人肺炎链球菌PspA蛋白多克隆抗体；质控线包被有抗兔IgG；检测层粘贴在底板上；结合垫和吸水垫分别设置在检测层两端部上方且与检测层部分重叠后分别与检测层和底板粘贴；样品垫设置在结合垫上方且与结合垫部分重合后分别与结合垫及底板粘贴。本发明专利技术具有操作简便、检测快速、可定量及高灵敏度等优点。

【技术实现步骤摘要】
人肺炎链球菌量子点免疫层析检测卡及其制备方法和应用
本专利技术涉及医学检测
，具体为一种人肺炎链球菌量子点免疫层析检测卡及其制备方法和应用。
技术介绍
人肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae，Sp)是儿童呼吸道感染的重要病原体。主要经飞沫传播而进入呼吸道，从而寄生于人体的鼻咽部，或侵入人体不易清除的部位引起一系列的疾病，如大叶性肺炎，脑膜炎，支气管炎，中耳炎等。它是全球所有年龄组高发病率和病死率的主要病原菌。其中，在发展中国家，婴幼儿、老年人及免疫缺陷人群中尤为严重。肺炎链球菌于1881年首次由巴斯德(LouisPasteur)及G.M.Sternberg分别在法国及美国从患者痰液中分离出。其为革兰氏染色阳性，菌体似矛头状，成双或成短链状排列的双球菌，有毒株菌体外有化学成分为多糖的荚膜。其荚膜具有抗原性，是肺炎链球菌分型的依据。根据荚膜多糖抗原性的不同将肺炎球菌分为91个血清型。其菌体抗原主要为C多糖，其存在于肺炎链球菌细胞壁中，具有种特异性，为各型菌株所共有。C多糖可被血清中C-反应蛋白沉淀。在钙离子存在时，C多糖可与正常人血清中称为C-反应蛋白(Creactiveprotein,CRP)的β球蛋白结合，发生沉淀。目前针对人肺炎链球菌抗原的检测亦主要是针对此抗原，而该抗原非肺炎链球菌独有，如缓和链球菌亦含有该抗原。在肺炎链球菌表面还有一种与毒力相关的重要抗原，为肺炎链球菌表面蛋白A(PspA)，其存在于所有肺炎链球菌血清型中，是肺炎链球菌的特异性抗原。但是PspA分子结构高度变异，具有抗原多样性，其富含脯氨酸的结构域上游被称为CDR域，具有多样性。根据CDR域的不同将PspA分为3个家族6亚类：Clade1,Clade2,Clade3,Clade4,Clade5,Clade6。其中Clade1，Clade2属于Fam1家族；Clade3，Clade4，Clade5属于Fam2家族，Clade6属于Fam3家族。具有Fam1或Fam2家族PspA蛋白的人肺炎链球菌占到了临床分离的人肺炎链球菌种类的99％以上。研究表明同一家族亚类间PspA蛋白间存在广泛的抗原抗体交叉反应，而异家族亚类间则无此交叉反应。临床病人由于不同的呼吸道病原体(如肺炎支原体、流感嗜血杆菌、流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等)感染引起疾病症状可以十分相似，这导致了流行诊断比较困难，确诊往往依赖于实验室诊断。快速有效的诊断方法应该是在疾病的发病初期就可以得到明确的诊断，便于实施针对性的治疗，阻止病情的发展迁延。尽管肺炎链球菌在全球范围内传播，婴幼儿的感染尤其普遍，但可用于实验室诊断的标准化商品试剂的种类极少。目前，肺炎链球菌的检测主要有以下几种方法：一、常规实验室检测1、细菌分离实验室诊断肺炎链球菌的金标准是分离人肺炎链球菌毒株。采用鼻咽分泌物作为病原体分离的标本，可以用血培养的方法分离病原体。但是该法有严重的缺陷，因为肺炎链球菌是苛养菌，营养要求高，培养所需时间长，阳性率低，更重要的是，若采样前患者使用过抗菌药物，会造成培养结果的假阳性。这样在临床方面对病人的治疗就有一定的局限性。2、血清学检测即采用酶联免疫法、放免法、微量免疫荧光法等，检测被检者血清中肺炎链球菌抗体水平，可间接提示肺炎链球菌感染的存在。然而，血清学试验只能提供一种回顾性的诊断，它需要同时检测患者急性期和恢复期的双份血清，如果恢复期中抗人肺炎链球菌抗体效价比急性期高4倍或4倍以上才有诊断意义。另外，抗体出现的时机不易掌握，且因为菌体血清型种类过多，导致其诱生的抗荚膜多糖抗体种类过多，对抗体的检测造成了很大的困难，故现有血清学方法的检测质量受到一定限制。二、快速诊断直接检查人肺炎链球菌蛋白抗原和菌体核酸可达到快速诊断的目的，目前主要有免疫荧光法、免疫酶法和PCR法等。免疫荧光法和免疫酶法均不能进行一步检测，均存在操作步骤复杂，需要专业人员操作，检测时间长(2h以上)，成本较高等缺点。PCR方法快速、灵敏、特异，是目前研究肺炎链球菌感染的重要手段，但由于PCR对实验设备以及操作要求较高，且易出现假阳性，在我国还不能作为常用的临床诊断方法。目前，检测人肺炎链球菌抗原的方法主要为胶体金法检测其C多糖抗原，但是胶体金法敏感度较低，对待检样品材料质量要求较高，同时还存在与其他链球菌如缓和链球菌存在交叉反应等缺陷。因此，建立具备高灵敏度的人肺炎链球菌特异性抗原快速诊断法十分必要。
技术实现思路
本专利技术针对
技术介绍
中现存的几种人肺炎链球菌在检测方式中遇到的技术瓶颈，提出了一种具有操作简便、检测快速、可定量及高灵敏度等优点的人肺炎链球菌量子点免疫层析检测卡及其制备方法和应用。本专利技术的目的是通过以下技术手段来实现的：一种人肺炎链球菌量子点免疫层析检测卡，其特征在于：所述人肺炎链球菌量子点免疫层析检测卡包括底板、样品垫、结合垫、检测层以及吸水垫；所述结合垫包被有量子点标记的抗人肺炎链球菌纳米探针；所述检测层是由带有一条检测线及一条质控线的固相硝酸纤维素膜构成；所述检测线包被有鼠抗人肺炎链球菌PspA蛋白多克隆抗体；所述质控线包被有抗兔IgG；所述检测层粘贴在底板上；所述结合垫以及吸水垫分别设置在检测层两端部的上方且与检测层部分重叠后分别与检测层以及底板粘贴在一起；所述样品垫设置在结合垫上方且与结合垫部分重合后分别与结合垫及底板粘贴在一起。作为优选，本专利技术所采用的量子点是羧基化两亲聚合物修饰的水溶性CdSe/ZnS量子点。作为优选，本专利技术所采用的抗兔IgG包括但不限于羊抗兔IgG。作为优选，本专利技术所采用的检测层长2cm，所述检测层粘贴在长度是6.6-7.7cm的底板表面中间段；所述检测层与粘贴在检测层以及底板上的且长度是2.5-3cm的吸水垫重叠0.2-0.4cm；所述检测层与粘贴在检测层以及底板上的且长度是0.5-0.8cm的结合垫重叠0.2-0.4cm；所述结合垫与粘贴在结合垫以及底板上的长度是2.5cm的样品垫重叠0.2—0.4cm；所述检测线与质控线的间距是0.5-0.8cm；所述底板的宽度是0.3-0.5cm。作为优选，本专利技术所采用的吸水垫是吸水滤纸；所述底板是PVC板。一种基于上述的人肺炎链球菌量子点免疫层析检测卡的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：1)结合垫的制备：1.1)重组PspA1-His、PspA2-His融合蛋白的制备、纯化：1.1.1)对人肺炎链球菌Fam1PspA、Fam2PspA蛋白进行生物信息学分析，分别获取人肺炎链球菌Fam1PspA、Fam2PspA蛋白胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段，找到其对应的基因序列；1.1.2)在步骤1.1.1)中所得到的基因序列的5’端及3’端分别引入酶切位点并分别化学合成全基因序列，同时标记为PspA1、PspA2；其序列参见序列表；1.1.3)将步骤1.1.2)中所得到的PspA1、PspA2按分子生物学方法分别克隆入表达载体pET-28a(+)后转入大肠杆菌中表达重组PspA1-His、PspA2-His融合蛋白；所述重组PspA1-His、PspA2-His融合蛋白均以可溶性表达形式存在于基因工程菌体中；1.1.4)用镍柱纯化步骤1.1.3)所得到的重组PspA1-Hi本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人肺炎链球菌量子点免疫层析检测卡，其特征在于：所述人肺炎链球菌量子点免疫层析检测卡包括底板、样品垫、结合垫、检测层以及吸水垫；所述结合垫包被有量子点标记的抗人肺炎链球菌纳米探针；所述检测层是由带有一条检测线及一条质控线的固相硝酸纤维素膜构成；所述检测线包被有鼠抗人肺炎链球菌PspA蛋白多克隆抗体；所述质控线包被有抗兔IgG；所述检测层粘贴在底板上；所述结合垫以及吸水垫分别设置在检测层两端部的上方且与检测层部分重叠后分别与检测层以及底板粘贴在一起；所述样品垫设置在结合垫上方且与结合垫部分重合后分别与结合垫及底板粘贴在一起。

【技术特征摘要】
1.一种人肺炎链球菌量子点免疫层析检测卡的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：1)结合垫的制备：1.1)重组PspA1-His、PspA2-His融合蛋白的制备、纯化：1.1.1)对人肺炎链球菌Fam1PspA、Fam2PspA蛋白进行生物信息学分析，分别获取人肺炎链球菌Fam1PspA、Fam2PspA蛋白胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段，找到其对应的基因序列；1.1.2)在步骤1.1.1)中所得到的基因序列的5’端引入酶切位点NdeI、在3’端引入终止信号TAA和酶切位点XhoI后分别化学合成全基因序列，同时分别标记为PspA1、PspA2；所述PspA1基因序列是：CATATGGTAAGAGCAGAAGAATCTCCCGTAGCCAGTCAGTCTAAAGCTGAGAAAGACTATGATGCNdeIAGCAGTGAAAAATGCTACAGCTGCAAAAAAAGCAGCAGAAGACGCTCAAAGAGCTTTAGATGAAGCAAAAGCTGCGCAGAAAAAATATGACGAGGATCAAAAGAAAACTGAGGAGAAAGCGAAAGAAGTAAAAAAAGCTTCGGAAGAAGAACAAGCTGCAAATCTGAAATATCAACAAGAGTTGGTTAAATATATTAAATATACACGTGAAAATAATTCAACAAAAAGAACTGAAGCTGAGAAAGTAATGACTGCAGCTAAGAAAGAGCATGAGAAAAAACAAACAGAACTTGCTAAAGTTCTCGCAAAGGTAATTCCTAGCGCGGAAGAATTAGAAAATACTAGACAAAAAGCAGAGAAAGCTAAAGAAAAAGAACCAGAGCTTACTAAAAAACTAGAAGAAGCTAAAGCAAAATCAGAAGAAGCTGAGAAAAAAGCTACTGAAGCCAAACAAAAAGTGGATGCAGAACATGCTGAAGAAGTCGTTCCTCAAGCTAAAATCGCTGAGTTGGAAAATGAAGTTCAGAAACTAGAAAAAGATCTCAAAGAGATTGATGAATCTGACTCAGAAGATTATGTTAAAGAAGGTCTCCGTGCTCCTCTTCAATCTGAATTGGATGCCAAACAAGCTAAACTATCAAAACTTGAAGAGTTGAGTGATAAGATTGATGAGTTAGACGCTGAAATTGCAAAACTTGAAAAAAATGTAGAAGATTTCAAAAACTCAAACGGTGAGCAAGCTGAACAATACCGTGCTGCAGCTGGAGAAGACTTAGCTGCTAAACAAGCTGAATTAGAAAAAACTGAAGCTGACCTTAAGAAAGCAGTTAATGAGCCAGAAAAACCAGCTCCAGCTCCAGAAACTCCAGCCCCAGAAGCACCAGCTGAACAACCAAAACCAGCGCCGGCTCCTCAACCAGCTCCCGCACCCAAACCAGAGAAGCCAGCTGAACAACCCAAAGCAGAAAAACCAGCTGATCAACAAGCTGAAGAAGACTATGATCGTAGATCAGAAGAAGAATATAACCGCTTGACCCAACAGCAACCGCCAAAAGCAGAAAAACCAGCTCCTGCATAACTCGAXhoIG所述PspA2基因序列是：CATATGCCTACTTTTGTAAGAGCAGAAGAATCTCCACAAGTTGTCGAAAAATCTTCATTAGAGAAGANdeIAATATGAGGAAGCAAAAGCAAAAGCTGATACTGCCAAGAAAGATTACGAAACGGCTAAAAAGAAAGCAGAAGACGCTCAGAAAAAGTATGAAGATGATCAGAAGAGAACTGAGGAGAAAGCTCGAAAAGAAGCAGAAGCATCTCAAAAATTGAATGATGTGGCGCTTGTTGTTCAAAATGCATATAAAGAGTACCGAGAAGTTCAAAATCAACGTAGTAAATATAAATCTGACGCTGAATATCAGAAAAAATTAACAGAGGTCGACTCTAAAATAGAGAAGGCTAGGAAAGAGCAACAGGACTTGCAAAATAAATTTAATGAAGTAAGAGCAGTTGTAGTTCCTGAACCAAATGCGTTGGCTGAGACTAAGAAAAAAGCAGAAGAAGCTAAAGCAGAAGAAAAAGTAGCTAAGAGAAAATATGATTATGCAACTCTAAAGGTAGCACTAGCGAAGAAAGAAGTAGAGGCTAAGGAACTTGAAATTGAAAAACTTCAATATGAAATTTCTACTTTGGAACAAGAAGTTGCTACTGCTCAACATCAAGTAGATAATTTGAAAAAACTTCTTGCTGGTGCGGATCCTGATGATGGCACAGAAGTTATAGAAGCTAAATTAAAAAAAGGAGAAGCTGAGCTAAACGCTAAACAAGCTGAGTTAGCAAAAAAACAAACAGAACTTGAAAAACTTCTTGACAGCCTTGATCCTGAAGGTAAGACTCAGGATGAATTAGATAAAGAAGCAGAAGAAGCTGAGTTGGATAAAAAAGCTGATGAACTTCAAAATAAAGTTGCTGATTTAGAAAAAGAAATTAGTAACCTTGAAATATTACTTGGAGGGGCTGATCCTGAAGATGATACTGCTGCTCTTCAAAATAAATTAGCTGCTAAAAAAGCTGAGTTAGCAAAAAAACAAACAGAACTTGAAAAACTTCTTGACAGCCTTGATCCTGAAGGTAAGACTCAGGATGAATTAGATAAAGAAGCAGAAGAAGCTGAGTTGGATAAAAAAGCTGATGAACTTCAAAATAAAGTTGCTGATTTAGAAAAAGAAATTAGTAACCTTGAAATATTACTTGGAGGGGCTGATTCTGAAGATGATACTGCTGCTCTTCAAAATAAATTAGCTACTAAAAAAGCTGAATTGTAACTCGAGXhoI1.1.3)将步骤1.1.2)中所得到的PspA1、PspA2按分子生物学方法分别克隆入表达载体pET-28a(+)后转入大肠杆菌中表达重组PspA1-His、PspA2-His融合蛋白；所述重组PspA1-His、PspA2-His融合蛋白均以可溶性表达形式存在于基因工程菌体中；1.1.4)用镍柱纯化步骤1.1.3)所得到的重组PspA1-His、PspA2-H...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡征，杨波，董俊，
申请(专利权)人：董俊，
类型：发明
国别省市：湖北;42