荧光免疫层析检测卡及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种荧光免疫层析检测卡及其制备方法和应用，荧光免疫层析检测卡包括处理液A、处理液B和检测卡，所述处理液A中含有偶联荧光微球的针对待测抗原的抗体1；所述处理液B中含有偶联生物素的针对待测抗原的抗体2，所述检测卡包括检测线区域和质控线区域，所述检测线区域固定有链霉亲和素检测T线，所述质控线区域固定有抗体质控C线。制备方法包括：(1)配制处理液A；(2)配制处理液B；(3)检测卡划线。该荧光免疫层析检测卡具有高灵敏度高、高特异性、高稳定性等特点，可应用于疾病标志物的快速检测。

Fluorescence immune chromatography detection card, preparation method and application thereof

The invention discloses a fluorescent immunochromatography detection card and preparation method and application thereof, fluorescence immunochromatography detection card including solution A, solution B and detection card, the treatment fluid containing A coupling fluorescent microspheres antibody to antigen to be detected 1; the treatment fluid containing biotin B coupling the antibodies against the antigen to be detected 2 of the detection card comprises a detection line and a quality control line region area, the detection line region is fixed with streptavidin to detect the T line, the control line area fixed antibody control C line. The preparation method comprises the following steps: (1) preparing a processing fluid A; (2) preparing a processing fluid B; and (3) detecting the card lineation. The fluorescent immunochromatographic assay card has the characteristics of high sensitivity, high specificity, high stability and so on. It can be used for rapid detection of disease markers.

【技术实现步骤摘要】
荧光免疫层析检测卡及其制备方法和应用
本专利技术涉及免疫测定
，尤其涉及一种荧光免疫层析检测卡及其制备方法和应用。
技术介绍
目前，检测疾病标志物的方法主要有放射免疫分析法(RIA)、酶联免疫分析法(ELISA)、电化学发光免疫分析法(ECLIA)和POCT法等。放射免疫法因提取样本或125I标记不稳定常出现较大误差，灵敏度和特异性相对较低，测定方法复杂、耗时长，并且所需样本量也较大，不是理想的测定方法。近年来，酶联免疫分析法在疾病的临床诊断中取得了广泛的应用，但是此方法试剂制备困难，操作步骤复杂、耗时长，影响因素多，控制难以保证，最后测定的是颜色的光密度，其精密度和敏感性不如发光免疫技术。目前，血清中的疾病标志物检测国内外主要采用RocheElesys电化学发光免疫分析系统，化学发光免疫分析法具有极高的灵敏度，可定量分析样本中疾病标志物的含量，且准确度高，但检测操作较POCT法复杂，且采用电化学发光免疫荧光法进行检测时多为批量采集样品进行检测，不适用于中小型医院及个人进行疾病标志物浓度的检测。除此之外，检测所需的昂贵的仪器和试剂价格限制了化学发光免疫分析法的广泛应用。采用POCT法使用现有的检测卡检测疾病标志物时，具有操作简单、成本低、能快速得到结果、仪器体积小方便携带等优点，但是灵敏度不高。因此有待开发一种通用的高灵敏度的疾病标志物检测卡。例如，心力衰竭是各种心血管疾病发展的终末阶段，病情凶险，死亡率高，如不能早期识别并及时处理，往往预后不佳，因此，对心力衰竭患者特别是急诊送诊的患者进行快速诊断并给予尽早的治疗非常重要。众多研究表明，氨基末端B型钠尿钛原(NT-proBNP)是很好的心衰诊断标志物。NT-proBNP浓度的检测对于临床上诊断心衰具有重要意义，NT-proBNP是美国和欧洲心脏病学会推荐使用的目前最好的用于评价心力衰竭的实验室检测指标。由于血清中NT-proBNP浓度极低，通常情况下，采用POCT法时，判断标准为是NT-proBNP浓度＞300ng/L即为阳性，使用传统的免疫荧光技术制备的心衰标志物检测卡在检测NT-proBNP时，灵敏度低，浓度极低的NT-proBNP很难被T线捕捉，难以检测。因此开发一种高灵敏度的心衰标志物检测卡应用于POCT法检测NT-proBNP十分重要。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种高灵敏度高、高特异性、高稳定性的荧光免疫层析检测卡及其制备方法和在疾病标志物快速检测中的应用。为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：一种荧光免疫层析检测卡，包括处理液A、处理液B和检测卡，所述处理液A中含有偶联荧光微球的针对待测抗原的抗体1；所述处理液B中含有偶联生物素的针对待测抗原的抗体2，所述检测卡包括检测线区域和质控线区域，所述检测线区域固定有链霉亲和素检测T线，所述质控线区域固定有抗体质控C线。上述的荧光免疫层析检测卡，优选地，所述荧光微球为荧光分子通过内部包埋的方式形成荧光微球，所述T线划线物质为链霉亲和素，所述C线划线抗体为羊抗鼠抗体。上述的荧光免疫层析检测卡，优选地，所述待测抗原为NT-proBNP。上述的荧光免疫层析检测卡，优选地，所述抗体1为抗体15C4或抗体5B6，所述抗体2为抗体13G12或抗体15F11。作为一个总的专利技术构思，本专利技术还提供一种荧光免疫层析检测卡的制备方法，包括以下步骤：(1)配制处理液A：(1.1)将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液和N-羟基琥珀酰亚胺溶液加入到羧基荧光微球中进行活化，活化后离心，收集沉淀，用磷酸盐缓冲液重悬，得到活化后的羧基荧光微球分散液；(1.2)将抗体1加入到步骤(1.1)所得的活化后的羧基荧光微球分散液中进行偶联反应，离心后取沉淀物，得到偶联抗体1的羧基荧光微球；(1.3)向步骤(1.2)所得的偶联抗体1的羧基荧光微球中加入牛血清白蛋白，封闭未偶联抗体的活化羧基位点，封闭后离心，取沉淀，加入抗体保存液，得到处理液A；(2)配制处理液B：将抗体2加入到生物素溶液中进行偶联反应，稀释后透析，以去除未结合的生物素，收集样品，得到处理液B；(3)检测卡划线：采用链霉亲和素溶液在检测卡的检测线区域内划T线，采用抗体溶液在检测卡的质控线区域内划C线。上述的荧光免疫层析检测卡的制备方法，优选地，所述步骤(1.1)中，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与羧基荧光微球的质量比为1∶1，所述N-羟基琥珀酰亚胺与羧基荧光微球的质量比为1∶1，活化时间为45min。上述的荧光免疫层析检测卡的制备方法，优选地，所述步骤(1.2)中，所述抗体1与羧基荧光微球的质量比为3∶500，所述偶联反应温度为4℃，时间为8h～12h。上述的荧光免疫层析检测卡的制备方法，优选地，所述步骤(2)中，所述抗体2与所述生物素的摩尔比为1∶50～200，偶联反应时间为4h，透析温度为4℃，时间为48h。上述的荧光免疫层析检测卡的制备方法，优选地，所述步骤(3)中，所述链霉亲和素溶液的浓度为10μg/μL，所述抗体溶液的浓度为1μg/cm。作为一个总的专利技术构思，本专利技术还提供一种上述的荧光免疫层析检测卡或上述的荧光免疫层析检测卡的制备方法所制备的荧光免疫层析检测卡在疾病的早期诊断中的应用。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：1、本专利技术基于荧光免疫层析法，同时结合生物素-链霉亲和素标记技术，提供了一种高灵敏度待测抗原检测卡及其制备方法。链霉亲和素与生物素都可与蛋白质(包括抗原、抗体、酶等)、荧光素等分子结合而不影响后者的生物活性，是理想的标记剂。一个抗体分子可偶联数十个生物素或链霉亲和素分子，而链霉亲和素或生物素分子又可与酶或荧光素结合，利用生物素和链霉亲和素之间极强的亲和力以及链霉亲和素具有多个结合位点的特性，从而组成一个生物放大系统，将信号多极放大，并且生物素-链霉亲和素系统(BAS)具有高特异性、高灵敏度、高稳定性的特点，使各种示踪免疫分析的特异性和灵敏度进一步提高。从而实现痕量物质快速灵敏的检测，成功地解决了痕量物质浓度太低造成难以检测的困扰。2、进一步地，本专利技术的目的通过以下技术方案实现：使用荧光分子通过内部包埋的方式形成荧光微球，所形成的荧光微球稳定，不易淬灭，亮度强，灵敏度高。链霉亲和素包被微粒子高效、均一、稳定、通用，生物素化抗体与样品中的抗原结合，使用链霉亲和素划线，利用生物素-链霉亲和素之间极强的结合力，促进标记有荧光微球的抗体1和生物素化的抗体2捕捉样品中的抗原，形成夹心结构的免疫复合物，通过标记有生物素的免疫复合物与T线上的链霉亲和素相结合，分别检测T线(检测线)上和C线(控制线)上的荧光强度,通过T线和C线上荧光强度的比值来定量样品中疾病标志物的浓度。链霉亲和素-生物素是最牢固和特异的结合，保证了牢固的包被效果和特异的检测结果。3、本专利技术的检测卡所需仪器设备体积小，携带如方便，操作简单易于掌握，无需专业人员操作，并且检测成本低。另外，只要针对不同的检测项目更换相应的处理液A和B，即可检测不同的疾病标志物。4、本专利技术尤其适用于NT-proBNP的快速检测，利用生物素-链霉亲和素标记技术与免疫荧光法制备的NT-proBNP检测卡能够较灵敏地检测出样本中微量的N本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种荧光免疫层析检测卡，包括处理液A、处理液B和检测卡，其特征在于，所述处理液A中含有偶联荧光微球的针对待测抗原的抗体1；所述处理液B中含有偶联生物素的针对待测抗原的抗体2，所述检测卡包括检测线区域和质控线区域，所述检测线区域固定有链霉亲和素检测T线，所述质控线区域固定有抗体质控C线。

【技术特征摘要】
1.一种荧光免疫层析检测卡，包括处理液A、处理液B和检测卡，其特征在于，所述处理液A中含有偶联荧光微球的针对待测抗原的抗体1；所述处理液B中含有偶联生物素的针对待测抗原的抗体2，所述检测卡包括检测线区域和质控线区域，所述检测线区域固定有链霉亲和素检测T线，所述质控线区域固定有抗体质控C线。2.根据权利要求1所述的荧光免疫层析检测卡，其特征在于，所述荧光微球为荧光分子通过内部包埋的方式形成荧光微球，所述T线划线物质为链霉亲和素，所述C线划线抗体为羊抗鼠抗体。3.根据权利要求1或2所述的荧光免疫层析检测卡，其特征在于，所述待测抗原为NT-proBNP。4.根据权利要求3所述的荧光免疫层析检测卡，其特征在于，所述抗体1为抗体15C4或抗体5B6，所述抗体2为抗体13G12或抗体15F11。5.一种如权利要求1～4任一项所述的荧光免疫层析检测卡的制备方法，包括以下步骤：(1)配制处理液A：(1.1)将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液和N-羟基琥珀酰亚胺溶液加入到羧基荧光微球中进行活化，活化后离心，收集沉淀，用磷酸盐缓冲液重悬，得到活化后的羧基荧光微球分散液；(1.2)将抗体1加入到步骤(1.1)所得的活化后的羧基荧光微球分散液中进行偶联反应，离心后取沉淀物，得到偶联抗体1的羧基荧光微球；(1.3)向步骤(1.2)所得的偶联抗体1的羧基荧光微球中加入牛血清白蛋白，封闭未偶联抗体的活化...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙宏浩，朱辉，陈佳，周昌荣，王竞争，
申请(专利权)人：武汉纽康度生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42