本发明专利技术涉及金刚烷胺快速时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条制备方法及其应用。该试纸条由Fusion5膜、硝酸纤维素膜和吸水纸三部分组成，通过竞争法原理，利用时间分辨荧光微球作为免疫标记物，对待测抗原进行准确快速的定量检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于食品安全检测领域，具体涉及食品中有害残留物的检测方法，特别是 金刚烷胺定量检测的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用。
技术介绍
金刚烷胺是最早用于抑制流感病毒的抗病毒药，羞里于亚洲感冒流行的1966年 批准其作为预防药。并于1976年在预防药的基础上确认其为治疗药。该药对成年患者的 疗效及安全性已得到广泛认同。但治疗剂量与产生副作用的剂量很接近，对高龄者及有慢 性心肺疾病或肾脏疾病者的剂量和给药计划很难确定，因此尚未在临床上推广应用。在且 灰，金刚烷胺一直作为帕金森病的治疗药，直到1998年才被批准用于流感病毒A型感染性 疾病的治疗。 金刚烷胺可用于亚洲甲-II型流感的预防和早期治疗，与抗菌素合用可治败血症 和病毒性肺炎，并有退烧作用。也有抗震颤麻痹的作用。适用于原发性帕金森病、脑炎后的 帕金森综合征、药物诱发的锥体外系反应、一氧化碳中毒后帕金森综合征及老年人合并有 脑动脉硬化的帕金森综合征。 根据其药理作用，国内现在主要将金刚烷胺用于鸡、猪流感的预防和早期治疗，及 猪传染性胃肠炎的防治。为避免影响国家动物疫病强制性免疫政策落实，给重大动物疫病 防控工作带来不良后果，农业部发布《关于清查金刚烷胺等抗病毒药物的紧急通知》，规 定除经批准生产、使用的疫苗产品外，禁止使用金刚烷胺防治高致病性禽流感等一类病原 微生物引起的病毒性疫病。 2005年农业部《关于清查金刚烷胺等抗病毒药物的紧急通知》，已将金刚烷胺、金 刚乙胺等列入《兽药地方标准废止目录》，明确要求立即停止生产、经营和使用，违者按生 产、经营假兽药和使用禁用兽药处理。 2005年中国政府《农业部公告（第560号）》也明确指出，"金刚烷胺类等人用抗 病毒药移植兽用，缺乏科学规范、安全有效实验数据，用于动物病毒性疫病不但给动物疫病 控制带来不良后果，而且影响国家动物疫病防控政策的实施。" 2012年11月底被爆出养殖的一只鸡从孵出到端上餐桌，只需要45天，是用饲料和药物 喂养的。其中一些不法商贩采用金刚烷胺人用药物，用于抑制禽类的禽流感等病症。其原 因是价格低廉，但如果用量不当会导致其在禽类体内残留或禽流感病毒变异，人体食用后 会对人体造成伤害。 我国对于动物源性食品中金刚烷胺残留含量的相关研究报道属于空白，也未曾制 定或立项过国家标准、行业标准，国际上也无特定限量要求及相应检测方法。研究食品中金 刚烷胺残留含量的检测技术，对于指导进出口食品中金刚烷胺含量控制，有效应对日本肯 定列表制度，及时消除潜在的出口贸易障碍，促进相关行业拓展国际市场，具有紧迫的现实 意义。 目前的免疫层析（lateral flow immunoassay, LFIA)快速检测试纸条多以胶体 金、彩色乳胶微球或者荧光素作为标记物。基于胶体金标记技术开发的快速检测产品，存在 定性或者半定量，批间差异较大等问题；彩色乳胶微球虽然批间差有所改进，但灵敏度依然 较低，也只能定性或半定量；基于荧光素标记技术的免疫层析灵敏度有了较大提高，也能进 行定量检测，但是由于样本中含有较高的荧光本底信号，且Stock位移较小，会对检测产生 较大的影响。 时间分辨突光（Time-resolved Fluorescence,TRF)是一种非同位素突光标记物， 与普通荧光相比，具有Stock位移大，荧光寿命长等特点，可以有效的避免样品中的本底荧 光，以及激发光等杂散光的影响，因此相比普通荧光具有更高的灵敏度和抗干扰能力。 本专利技术利用Fusion5替代传统的样品垫、滤血膜、结合垫，将原有的四层甚至五层 膜系统简化，开发出只需要三层膜结构的快速定量免疫层析检测试纸，不仅使生产工艺得 到了简化，而且有效的降低了产品的批内差和批间差，提高了检测灵敏度，极具实用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了提供新型的、能快速定量检测金刚烷胺的时间分辨荧光免疫 层析检测试纸条及其制备方法和应用。 本专利技术一方面公开了金刚烷胺时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条，该试纸条 包括Fusion5膜、硝酸纤维素膜以及吸水纸三部分。硝酸纤维素膜位于中间，Fusion5膜与 吸水纸分别搭接于硝酸纤维素膜左右两端。其中，Fusion5膜上设有加样区和微球区，微球 区上载有时间分辨荧光微球；硝酸纤维素膜上设有检测线（T线）和质控线（C线)，T线接上 包被金刚烷胺抗原，C线包被抗兔抗体。 本专利技术的优点是能快速检测出组织中金刚烷胺的含量。 所述金刚烧胺时间分辨突光微球，包括检测微球和质控微球，检测微球为表面包 被有金刚烧胺单抗的突光微球，质控微球为表面包被有兔抗标记蛋白的突光微球。 所述荧光微球中填充了斓系元素化合物；较优的，该斓系元索鳌合物为铕鳌合物； 最优的，该铕鳌合物可为Eu (TTA) 3/Τ0Ρ0或Eu (TTA) 3/Phen。 所述蛋白可以是牛血清Y -球蛋白（BGG)或小牛血清白蛋白（BSA)。 所述时间分辨荧光微球粒径范围为100 - 1000 nm。 所述硝酸纤维素膜上，T线上包被的抗原为金刚烷胺抗原，C线上包被的抗兔抗 体。 所述金刚烷胺时间分辨荧光免疫定量检测试纸条底部设有塑料底板。 本专利技术第二方面公开了金刚烷胺时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条的制备 方法，包括以下步骤： ⑴.质控微球制备： ① 用生物素标记蛋白； ② 采用上述标记蛋白包被醛基修饰的荧光微球； (2) .检测微球制备 采用金刚烷胺的单抗包被醛基修饰的荧光微球； (3) .空白大卡粘贴 在带有背胶的塑料底板上采用搭接的方式，首先粘贴硝酸纤维素膜，然后在硝酸纤维 素膜左右两端分别粘贴吸水纸和Fusion5膜； ⑷.喷膜 将兔抗标记蛋白的荧光微球和金刚烷胺单抗的荧光微球采用释放缓冲液混合稀释到 一定浓度，喷到Fusion5膜的微球区；金刚烷胺抗原和抗兔抗体稀释后，分别喷到硝酸纤维 素膜的T线和C线位置； (5).干燥及切条。 将上述喷好试剂的大卡烘干、切条。 步骤⑷中用到的释放缓冲液含有10 - 15%蔗糖、3 - 10%海藻糖、0. 5 - 1%N，0 -双三甲硅基乙酰胺（BSA)，0. 1 - 0. 5%庆大霉素。 步骤⑷稀释后检测微球终浓度为0.5 - 3 mg/mL，质控微球终浓度0.05 - 0.2 mg/mL;T线抗原终浓度0.5 - 3 mg/mL，C线抗原终浓度0.5 - 23mg/mL;C，T线喷膜液量为 0· 5 - 1. 5 μ 1/cm，微球喷膜量为 2 - 10 μ 1/cm。 步骤(5)中所述的烘干可在恒温烘箱或者烘房中，37°C烘干12 - 16小时。 本专利技术第三方面公开了金刚烷胺时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条的应用。 本专利技术的试纸条可通过竞争法原理测定生物分子，适用于所有的采用竞争法模式 的免疫层析检测。 本专利技术的金刚烷胺时间分辨荧光免疫层析试纸条灵敏度高，批内精密度可达10% 左右，批间精密度可达15%，可同时检测全血、血清、血浆、尿液样本，250 mg/dL血红蛋白、 500 mg/dL甘油三脂，10 mg/dL胆红素对本试纸条的检测无影响，远超过市场上大多数免疫 层析快速诊断产品。【附图说明】 图1本专利技术试纸条结构示意图（1.塑料底板，2. Fusion5膜，3.硝酸纤维素本文档来自技高网...
【技术保护点】
金刚烷胺快速时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条，其特征在于：包括Fusion5膜、硝酸纤维素膜以及吸水纸三部分，硝酸纤维素膜位于中间，Fusion5膜与吸水纸分别搭接于硝酸纤维素膜左右两端，Fusion5膜上有加样区和微球区，微球区上载有金刚烷胺单克隆抗体时间分辨荧光微球；硝酸纤维素膜上有检测线和质控线，检测线上包被金刚烷胺抗原，质控线上包被抗兔抗体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杜道林，邢海龙，洪霞，
申请(专利权)人：江苏维赛科技生物发展有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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