HER-2的荧光免疫层析检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术涉及HER-2的荧光免疫层析检测方法及其检测试剂盒。该方法步骤为探针固定垫制备、免疫层析试纸条制备、样品稀释液制备和样品检验，其中，将HER-2单克隆抗体荧光胶乳微粒与羊抗兔IgG荧光胶乳微粒混合后经金稀释液稀释喷在玻璃纤维上制得探针固定垫，并将HER-2单克隆抗体包被在检测线上，将羊抗兔IgG包被在控制线上进而制得免疫层析试纸条。本发明专利技术检测试剂盒包括免疫层析检测卡，其包括PVC衬板、样品垫、探针固定垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，该探针固定垫由HER-2单克隆抗体荧光胶乳微粒和羊抗兔IgG荧光胶乳微粒混合干燥制得。因此，本发明专利技术具有检测灵敏度高、准确度高、操作简单、成本低的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种HER-2的检测方法及试剂盒，尤其涉及HER-2的荧光免疫层析检测方法及其检测试剂盒。
技术介绍
HER-2基因，人类表皮生长因子受体2基因，也称为nen、C-erbB-2、Her-2/neu基因，其表达的蛋白产物为人表皮生长因子受体2，HER-2基因通过表达HER-2蛋白发挥作用。HER-2原癌基因位于17号染色体长臂，最早Shih等人用3-甲基胆蒽诱导鼠NIH3T3培养细胞系，并在转变出的神经母细胞瘤瘤细胞中将其检测到。在人类，20 %?30 %乳腺癌患者癌细胞有过度表达，其原因主要是HER-2基因扩增(95%)或转录增多(5%)。HER-2是表皮生长因子受体(EGFR)家族的一员，当细胞外相应片段与HER-2结合后可激活细胞内酪氨酸激酶，从而活化其它一系列细胞内信息传递途径，最终信号到达核内，导致调控细胞复制和分化的基因发生转录。正常人体细胞一般较少表达或适度表达HER-2蛋白，起到调控正常细胞生长和发育的作用。而在肿瘤组织中，HER-2基因大量扩增，导致HER-2蛋白过度表达，引起细胞增殖迅速、生长失控、促进乳腺癌进展。临床资料分析显示，HER-2基因扩增或蛋白过表达的早期乳腺癌患者10年生存率显著低于HER-2低表达组，HER-2基因扩增或蛋白过表达的复发转移乳腺癌患者的中位生存期仅为3年，而HER-2阴性患者的中位生存期为6-7年。因此，HER-2过表达是提不乳腺癌预后较差的指标之一，其在乳腺癌中过度表达的意义及其检测方法一直是人们关注的热点。目前对HER-2基因的研究取得了突破性进展，1987年，Slamon等人首先报道了HER-2扩增和临床预后不良之间的显著关系，其显著性高于雌激素(ER)、孕激素(PR)等指标，并在以后的研究中得到大量证实。之后人们发现HER-2高表达乳腺癌患者对三苯氧胺治疗、单独的激素疗法、以及环磷酰胺、甲氨喋呤、5-氟脲嘧啶联合化疗产生耐受，而对泰素、阿霉素治疗变的更敏感。近年来，一种针对HER-2的单克隆抗体类药物研制成功，并已得到美国食品及药物管理局许可用于临床治疗三期乳腺癌，它只针对HER-2高表达的肿瘤细胞产生作用，可有效延长患者生存期并使其生活质量得到改善，是一种极有前途的疗法。因此，乳腺癌患者有无HER-2高表达，如何客观准确地对其加以检测，对患者治疗方法的选择以及预后具有极为重要的意义。目前国内国外开发的HER-2检测方法有免疫组化或FISH检测，这些方法检测步骤多，检测过程影响因素较多，检测结果易造成偏差。现有技术荧光层析免疫分析方法是一种微量分析方法，根据荧光强度，对物质进行定性或定量分析，具有高灵敏度、选择性强、需样量少和操作简便等优点。中国专利公布号为CN104195246A的专利技术专利，公布了一种基于HER-2基因快速FISH检测的HER-2试剂盒，通过碱基互补配对的原则，特定的DNA序列与细胞内的目标序列互补结合，探针带有荧光，在合适的激发光照射下，杂交探针及目标DNA能够被检测出来，采用优化的短序列荧光探针，使得所需要的杂交时间缩短，可以将FISH的检测时间缩短至1?2h。然而该方法检测步骤有洗涤、除菌、杂交、孵育、检测等，检测过程复杂，繁琐，消耗时间长，需要专业人员进行操作，特别是对检测环境有严格要求，不利于大批量的样本检测。中国专利公布号为CN104122394A的专利技术专利，公布了一种酶促化学发光法检测HER-2定量测定试剂盒，采用含有小鼠抗人HER-2的单克隆抗体复合物的纳米磁性微球固定HER-2，然后与含有碱性磷酸酶标记的抗HER-2单克隆抗体结合，通过与酶促化学发光底物的反应产生信号。该方法需要将不同的HER-2抗体与纳米磁珠和磷酸酶结合，成本较高；操作步骤有HER-2的固定、温浴、去上清、清洗、化学发光反应和发光检测仪检测，操作复杂，容易带来误差，需专业人员，检测时间较长。因此，如何开发检测时长短、操作方便、检测结果精确的HER-2检测方法和检测产品成为亟待解决的问题。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种灵敏度高、准确度高、操作简单、成本低的HER-2的检测方法及试剂盒。本专利技术一种HER-2的荧光免疫层析检测方法，包括以下步骤:步骤1)探针固定垫制备:将HER-2单克隆抗体按比例与活化白蛋白荧光胶乳微粒偶联反应制得HER-2单克隆抗体荧光胶乳微粒，再将所述HER-2单克隆抗体荧光胶乳微粒与羊抗兔IgG荧光胶乳微粒按一定比例混合得到混合荧光胶乳微粒，所述混合荧光胶乳微粒用荧光探针微球稀释液稀释后喷在玻璃纤维上制得探针固定垫；步骤2)免疫层析试纸条制备:将样品垫、探针固定垫、层析膜、吸水纸依次贴在PVC衬板上，将所述HER-2单克隆抗体包被在层析膜的检测线上，将羊抗兔IgG包被在层析膜控制线上，进而制得免疫层析试纸条，所述层析膜优选硝酸纤维素膜；步骤3)样品稀释液制备:将包括有牛血清白蛋白、表面活性剂、分散剂和防腐剂的混合物与缓冲液混合均匀制得样品稀释液；步骤4)样品检验:取血清样品混合至所述样品稀释液，加入免疫层析试纸条进行免疫层析反应，层析反应结束后经荧光检测器荧光检测。本专利技术进一步地，步骤1)中，所述活化白蛋白荧光胶乳微粒的制备是先将荧光胶乳微粒与活化剂反应制得活化荧光胶乳微粒，再与白蛋白按比例偶联反应得白蛋白荧光胶乳微粒，所述白蛋白与活化荧光胶乳微粒的比例为0.05:100?0.2:100，所述白蛋白荧光胶乳微粒进一步与活化剂反应制得所述活化白蛋白荧光胶乳微粒。本专利技术更进一步地，所述白蛋白的种属包括人、牛、羊或鼠。本专利技术更进一步地，步骤1)中，所述羊抗兔IgG荧光胶乳微粒的制备是将羊抗兔IgG按比例与活化荧光胶乳微粒偶联反应制得，所述羊抗兔IgG与活化荧光胶乳微粒的混合比例为 0.05:100 ?0.2:100。本专利技术更进一步地，步骤1)中，所述活化剂包括1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，二者重量比为1:6?1:1，所述1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与荧光胶乳微粒的重量比为1:100?5:100。三者混合后可在室温下反应0.5?lh。本专利技术进一步地，步骤1)中，所述HER-2单克隆抗体与活化荧光胶乳微粒的混合比例为0.05:100?0.2:100，混合后可在室温下偶联反应1?5h ;所述HER-2单克隆抗体荧光胶乳微粒和羊抗兔IgG荧光胶乳微粒相混合的比例2:1?6:1，混合后室温下偶联反应1 ?5h。本专利技术进一步地，步骤1)中，将混合荧光胶乳微粒用荧光探针微球稀释液稀释2?6倍，以2?6ul/cm的速度均匀喷在宽度为0.7?1.3cm的玻璃纤维上，在30?55°C下干燥2?24h后制得探针固定垫。本专利技术进一步地，所述荧光探针微球稀释液为含有蔗糖、牛血清白蛋白和表面活性剂的缓冲液，所述缓冲液包括PBS缓冲液、Tris缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液中的一种或几种，所述表面活性剂为吐温20或吐温80。本专利技术进一步地，步骤3)中，所述缓冲液包括PBS缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液中的一种或几种，所述表面活性剂为吐温20、吐温80、曲拉通X-100或聚乙二醇，所述防本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种HER‑2的荧光免疫层析检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1)探针固定垫制备：将HER‑2单克隆抗体按比例与活化白蛋白荧光胶乳微粒偶联反应制得HER‑2单克隆抗体荧光胶乳微粒，再将所述HER‑2单克隆抗体荧光胶乳微粒与羊抗兔IgG荧光胶乳微粒按一定比例混合得到混合荧光胶乳微粒，所述混合荧光胶乳微粒用荧光探针微球稀释液稀释后喷在玻璃纤维上制得探针固定垫；步骤2)免疫层析试纸条制备：将样品垫、探针固定垫、层析膜、吸水纸依次贴在PVC衬板上，将所述HER‑2单克隆抗体包被在层析膜的检测线上，将羊抗兔IgG包被在层析膜控制线上，进而制得免疫层析试纸条；步骤3)样品稀释液制备：将包括有牛血清白蛋白、表面活性剂、分散剂和防腐剂的混合物与缓冲液混合均匀制得样品稀释液；步骤4)样品检验：取血清、血浆或全血样品混合至所述样品稀释液，加入免疫层析试纸条进行免疫层析反应，层析反应结束后经荧光检测器荧光检测。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张金林，张华，廖平璋，张鹏，
申请(专利权)人：苏州市博纳泰科生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32