脂蛋白相关磷脂酶A2测定试剂盒及制作方法技术

本发明专利技术涉及医学免疫学中荧光免疫层析技术领域，具体地说是一种脂蛋白相关磷脂酶A2测定试剂盒及制作方法，设有试纸卡，其特征在于所述试纸卡由下至上依次设有：PVC板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中结合垫上吸附有稀土Eu

Lipoprotein related phospholipase A2 assay kit and method of making the same

The present invention relates to medical immunology fluorescence immunochromatographic technology field, in particular to a lipoprotein associated phospholipase A2 assay kit and a preparation method thereof, a test card, which is characterized in that the test card followed by the bottom is provided with a PVC plate, a sample pad, combination pad, nitrocellulose membrane and absorbent pad, which combined pad adsorbed rare earth Eu

【技术实现步骤摘要】
脂蛋白相关磷脂酶A2测定试剂盒及制作方法
：本专利技术涉及医学免疫学中荧光免疫层析
，包括蛋白交联技术、膜层析技术、标记免疫分析技术等。具体地说是一种能够快速准确的对血清、血浆和全血等样品中脂蛋白相关磷脂酶A2进行定量分析的脂蛋白相关磷脂酶A2测定试剂盒及制作方法。
技术介绍
：随着对动脉粥样硬化发病机制的深入研究，人们发现在动脉粥样硬化发生、发展的演变过程中，始终都有各种炎症细胞核大量炎症介质的参与，炎症是动脉粥样硬化发展过程中的核心因素。Lp-PLA2是近年来引起广泛关注的一种与动脉粥样硬化心、脑血管疾病密切相关的磷脂酶A2超家族，越来越多的研究表明Lp-PLA2与冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)脑卒中事件的发生关系密切。Lp-PLA2是针对血管内皮炎症即AS严重程度的特异性炎症标记物，可以有效预警、评估心脑血管栓塞性疾病的发生风险，降低心脑血管患者或高危人群突发心梗/脑梗等严重不良事件的发生率，为生命保驾护航。脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)是目前国际上公认的一种新的炎性反应标志物。血液中的Lp-PLA2主要由巨噬细胞产生，能水解低密度脂蛋白(LDL)中氧化的磷脂，其水解产物可促进动脉粥样硬化过程，为反映血管炎症的特异性标志物。Lp-PLA2水平升高还与动脉粥样硬化斑块的破溃相关，因而可用于动脉粥样斑块不稳定性评价。Lp-PLA2水平升高是预测冠心病、心血管事件和卒中风险的一种独立危险因素和预测因子。免疫分析技术是利用微量抗原与相应的高特异性抗体之间的免疫反应，来检测如激素、药物、蛋白质、多肽、酶、肿瘤相关抗原、微生素、病毒、细菌及金属元素等生物体内活性物质。免疫分析技术包括标记免疫分析、非标记免疫分析和仪器免疫分析。本试剂盒利用的含有稀土元素的羧基乳胶微球标记免疫分析技术是属于标记免疫分析之一种。荧光免疫分析(FIA)和放射免疫分析(RIA)自问世以来，经历了几十年的发展，但是人们越来越感觉到FIA因自然本地太高，干扰检测结果；RIA采用同位素标记，对人体有极大危害并给实验带来不便。酶免疫分析(EIA)也因酶本身不稳定，受其他影响因素较大，推广应用受到限制。80年代初，人们开始研究用稀土元素代替荧光物质和同位素标记蛋白质或抗体，将时间分辨技术引入到生物检测领域，建立了新型的超微量时间分辨荧光免疫分析技术(TimeresolvedFluoroimmunoassay，简称TrFIA)。该技术采用多学科先进技术，集结了其他免疫分析的特点，在免疫学、分子生物学、细胞学和医学等领域，取得长足的发展和广泛应用。TrFIA利用了具有独特荧光特性的3价稀土离子及螯合物为示踪物代替荧光物质、酶、同位素、化学发光物质，标记抗体、抗原、激素、多肽、蛋白质、核酸探针及生物细胞，待反应体系(如抗原抗体反应、核酸探针杂交、生物素亲和素反应以及靶细胞对效应细胞的杀伤效应等)发生后，用TrFIA检测仪测定反应产物中的荧光强度。根据产物荧光强度和相对荧光强度的比值，判断反应体系中分析物的浓度，从而达到定量分析。在通常的荧光测定中，由于测试样品中含有多种荧光成分，背景荧光(来自样品中的胶体颗粒和溶剂分子引起的散射光以及血清中蛋白质和其他化合物发出的非特异性荧光)强度大、干扰强，成为荧光分析法大范围推广的瓶颈。TrFIA之所以能够成为继EIA、RIA之后一种新的灵敏的检测方法，主要取决于镧系元素独特的荧光特点、检测中采用的波长分辨和时间延迟技术以及解离-增强技术。镧系元素(lanthanide,Ln)属于稀土元素，共有17中，常用于TrFIA主要有铕(Eu)、钐(Sm)、铽(Tb)、镝(Dy)。镧系元素具有独特的荧光发光特点，与普通荧光相比，镧系离子螯合物荧光衰变时间长，为传统荧光的103-106倍。如镧系离子螯合物的荧光衰变时间在60-900μs，常用的Eu3+荧光衰变时间为714μs，普通荧光免疫分析中荧光团的荧光衰变时间只有1-100μs，样品中一些蛋白质的荧光衰变时间仅为1-10μs，因此利用时间分辨技术，延迟一定时间后测量，便可获得Eu3+特异性荧光信号。同时由于衰变时间长，Eu3+标记物在测量时间里可以反复被激发，每次激发后由激发态很快跃迁到基态，就有荧光发出，然后又可被重新激发，如此每秒可有1000次激发，使得TrFIA荧光标记物的相对比活性很高。镧系元素荧光光谱的最大特征是激发光与发射光之间的Stokes位移较大，Eu3+激发波长为337nm，发射波长为615nm，Stokes位移可达278nm；同时Eu3+被激发的荧光光带极窄，荧光的发射峰非常尖锐，可使仪器调整在极窄的波长范围内测定，这样就几乎完全消除了背景荧光的干扰，继而通过时间延迟和波长分辨，将强特异性荧光和背景荧光辨开(故称为时间分辨)，使干扰达到几乎为零。鉴于以上标记方法及检测技术的应用，本试剂盒具有良好的检测特异性、较高的灵敏度、操作的简便性以及稳定的荧光标记物保证了检测的准确性。
技术实现思路
：本专利技术针对现有技术中存在的缺点和不足，提出了一种利用荧光免疫层析的灵敏性，结合荧光免疫层析分析仪实现的灵敏度高、快捷简便，可以准确定量的脂蛋白相关磷脂酶A2测定试剂盒及制作方法。本专利技术可以通过以下措施达到：一种脂蛋白相关磷脂酶A2测定试剂盒，设有试纸卡，其特征在于所述试纸卡由下至上依次设有：PVC板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中结合垫上吸附有稀土荧光微球标记的抗脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体-微球偶联复合物，所述稀土荧光微球的直径为100-250nm，稀土荧光微球含稀土镧系元素中的一种或几种，在基态下稳定，在300-400nm的激发光源作用下发射出波长范围为550-650nm的荧光；所述单克隆抗体为纯化后混合的单克隆抗体，来源于针对2-6个不同的脂蛋白相关磷脂酶A2抗原表位的单克隆抗体细胞株。本专利技术所述结合垫的稀土荧光微球的直径优选是120-200nm；所述稀土荧光微球优选含有一种或几种稀土镧系元素；结合垫上稀土荧光微球标记的抗体优选来源于针对2个不同抗原表位的单克隆细胞细胞株。本专利技术所述结合垫采用如下步骤制得：将玻璃纤维膜浸泡于150mMTris-HCL处理液中(含1.0％TritonX-100，2.5％BSA，pH7.4)，4℃浸泡2小时，然后取出37℃烘箱烘干4小时，备用，将玻璃纤维膜放在Bio-DotXYZ3050三维喷点平台上，用Bio-JetQuanti300非接触式微定量喷头将稀土荧光微球标记的抗脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体偶联复合物喷到玻璃纤维膜，37℃烘干1小时后制得。本专利技术中结合垫上的所述稀土荧光微球标记的抗脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体采用如下步骤制得：步骤1：单克隆抗体细胞株的获得：用脂蛋白相关磷脂酶A2纯品免疫小鼠，采用标准的单克隆抗体制备方法制备特异性高亲和力的单克隆抗体细胞株，对所获得的单抗细胞株进行配对筛选，根据配对结果和亲和力数据优选出用于试剂盒的单抗细胞株；步骤2：单克隆抗体的制备：采用标准的腹水生产工艺制备并纯化抗脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体，分装后保存于-20℃备用；步骤3：稀土荧光微球的醛基化：取5mg稀土荧光微球，用20mM，pH9.5的碳酸盐缓冲液，采用离心法洗涤3遍，离心速本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种脂蛋白相关磷脂酶A2测定试剂盒，设有试纸卡，其特征在于所述试纸卡由下至上依次设有：PVC板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中结合垫上吸附有稀土荧光微球标记的抗脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体‑微球偶联复合物，所述稀土荧光微球的直径为100‑250nm，稀土荧光微球含稀土镧系元素中的一种或几种，在基态下稳定，在300‑400nm的激发光源作用下发射出波长范围为550‑650nm的荧光；所述单克隆抗体为纯化后混合的单克隆抗体，来源于针对2‑6个不同的脂蛋白相关磷脂酶A2抗原表位的单克隆抗体细胞株。

【技术特征摘要】
1.一种脂蛋白相关磷脂酶A2测定试剂盒，设有试纸卡，其特征在于所述试纸卡由下至上依次设有：PVC板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中结合垫上吸附有稀土荧光微球标记的抗脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体-微球偶联复合物，所述稀土荧光微球的直径为100-250nm，稀土荧光微球含稀土镧系元素中的一种或几种，在基态下稳定，在300-400nm的激发光源作用下发射出波长范围为550-650nm的荧光；所述单克隆抗体为纯化后混合的单克隆抗体，来源于针对2-6个不同的脂蛋白相关磷脂酶A2抗原表位的单克隆抗体细胞株。2.根据权利要求1所述的一种脂蛋白相关磷脂酶A2测定试剂盒，其特征在于所述结合垫的稀土荧光微球的直径是100-200nm；所述稀土荧光微球掺杂有稀土镧系元素Eu3+。3.根据权利要求1所述的一种脂蛋白相关磷脂酶A2测定试剂盒，其特征在于所述稀土荧光微球含稀土镧系元素Eu3+；结合垫上稀土荧光微球标记的抗体来源于针对2个不同抗原表位的单克隆细胞细胞株。4.根据权利要求1所述的一种脂蛋白相关磷脂酶A2测定试剂盒，其特征在于所述结合垫采用如下步骤制得：将玻璃纤维膜浸泡于150mMTris-HCL处理液中(含1.0％TritonX-100，2.5％BSA，pH7.4)，4℃浸泡2小时，然后取出37℃烘箱烘干4小时，备用，将玻璃纤维膜放在Bio-DotXYZ3050三维喷点平台上，用Bio-JetQuanti300非接触式微定量喷头将稀土Eu3+荧光微球标记的抗脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体偶联复合物喷到玻璃纤维膜，37℃烘干1小时后制得。5.根据权利要求1所述的一种脂蛋白相关磷脂酶A2测定试剂盒，其特征在于结合垫上的所述稀土荧光微球标记的脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体采用如下步骤制得：步骤1：单克隆抗体细胞株的获得：用脂蛋白相关磷脂酶A2纯品免疫小鼠，采用标准的单克隆抗体制备方法制备特异性高亲和力的单克隆抗体细胞株，对所获得的单抗细胞株进行配对筛选，根据配对结果和亲和力数据优选出用于试剂盒的单抗细胞株；步骤2：单克隆抗体的制备：采用标准的腹水生产工艺制备并纯化脂蛋白相...

【专利技术属性】
技术研发人员：王鹏浩，李红江，宋璐琳，王文亮，刘衍亮，于鸿翔，
申请(专利权)人：威海纽普生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37