检测三聚氰胺残留的荧光微球免疫层析试纸条及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种检测三聚氰胺残留的荧光微球免疫层析试纸条及其制备方法和应用。试纸条包括底板及在底板上依次搭接粘贴的样品结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，样品结合垫上包埋有荧光微球标记的抗三聚氰胺单克隆抗体，硝酸纤维素膜上固定有检测区和质控区，检测区喷涂有三聚氰胺半抗原‑载体蛋白偶联物，质控区喷涂有羊抗鼠抗抗体。本发明专利技术主要用于三聚氰胺残留的检测，具有灵敏度高、检测快速、操作方便、经济实用等优点。

Fluorescent microsphere immune chromatography test strip for detecting residual of melamine and preparation method and application thereof

The invention discloses a fluorescent microsphere immune chromatography test strip for detecting residual of melamine and a preparation method and an application thereof. The strip comprises a bottom plate and a bottom plate are lapped in paste samples combination pad, nitrocellulose membrane and absorbent pad, pad with samples embedded with anti melamine monoclonal antibody labeled with fluorescent microspheres, detection zone and a control zone is fixed on the nitrocellulose membrane, spray coated with melamine detection hapten carrier protein conjugates and the quality control area coated with Goat anti mouse antibody. The invention is mainly used for detecting the residual of melamine, and has the advantages of high sensitivity, fast detection, convenient operation, economy and practicability.

【技术实现步骤摘要】
检测三聚氰胺残留的荧光微球免疫层析试纸条及其制备方法和应用
本专利技术属于食品安全中非法添加物检测领域，具体涉及一种检测样品中三聚氰胺残留的荧光微球免疫层析试纸条及其制备方法和应用。技术背景三聚氰胺简称三胺，化学名1,3,5-三嗪-2,4,6-三氨，分子式为C3N6H6，相对分子质量为126.12，是一种低毒无味的纯白色单斜棱晶体，广泛应用于涂料、建材、造纸、皮革、纺织等行业中。由于三聚氰胺的含氮量高达66％，是蛋白质平均含氮量的4倍，而常用的凯氏定氮法测定样品中的蛋白质含量时却不能区分这种非蛋白氮，因此被不法商贩利用添加在饲料和食品中以提高食品和饲料中粗蛋白质检测数值。动物实验表明，三聚氰胺对于哺乳动物属于微毒、低毒类化学物质，长期饲喂可能造成生殖、泌尿系统的损害，膀胱、肾部出现结石，并可进一步诱发膀胱癌。联合国负责食品安全标准的机构国际食品法典委员会2010年7月6日表示，该委员会已就食品中三聚氰胺的允许含量设立了新标准。新标准规定，每千克婴儿配方奶粉中的三聚氰胺含量不能超过1mg，而每千克其他食品或动物饲料中的三聚氰胺含量不能超过2.5mg。因此，加强对三聚氰胺检测技术的研究和快速检测技术的发展是非常有必要的。目前，检测三聚氰胺比较经典的方法有高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱/质谱法(LC-MS/MS)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)等，这些都是比较传统的方法，也是目前的确证方法。另外，目前常用的还有酶联免疫法(ELISA)。但由于以上方法均需先进检测仪器，检测费用昂贵、步骤繁琐耗时，且对操作人员专业性要求较高，不适用于基层企事业单位的大通量快速筛查检测。胶体金免疫层析法具有检测速度快、价格便宜、操作简单等优点，是目前国内外检测三聚氰胺的主要监控方法，但仍存在一些缺陷，如稳定性较差、灵敏度较低、无法实现定量检测、基质效应明显背景干扰大，且颜色单一，难以实现多检和联检。荧光微球免疫层析技术是继胶体金免疫层析技术后，在荧光染料标记技术上发展起来的，作为一种免疫学检测方法，它是免疫亲和技术、免疫标记技术、免疫层析技术的结合，与胶体金免疫层析技术一样具有快速、操作简便等优点。但是相比胶体金等传统标记物，荧光微球的发光强度可以随激发光的强度增强而增强，所以荧光微球标记有望提高免疫层析技术的检测限；而在微球壳结构的作用下，荧光微球具有相对稳定的形态结构，粒度均一、单分散性好、稳定性好、发光效率高、重复性好，有较好的生物相容性；且形成微球后染料荧光猝灭大大减少，发射强而稳定，且基本不受外界环境介质变化的影响。因此相比上述检测方法，荧光微球免疫层析技术同时具有检测灵敏度高、操作简便的优点。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是针对上述现有技术的缺陷，提供一种灵敏度高、操作简便、检测快速、价格低廉的检测三聚氰胺残留的荧光微球免疫层析试纸条；本专利技术的另一个目的是提供上述试纸条的制备方法；本专利技术的再一个目的是提供上述试纸条在检测三聚氰胺中的应用。为了实现上述目的，本专利技术采取的一个技术方案是：提供一种检测三聚氰胺残留的荧光微球免疫层析试纸条，它包括底板及在底板上依次搭接粘贴的样品结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述样品结合垫上包埋有荧光微球标记的抗三聚氰胺单克隆抗体，所述硝酸纤维素膜上固定有检测区和质控区，检测区喷涂有三聚氰胺半抗原-载体蛋白偶联物，质控区喷涂有羊抗鼠抗抗体。所述三聚氰胺半抗原-载体蛋白偶联物是由三聚氰胺半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清白蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白或人血清白蛋白，所述三聚氰胺半抗原是由三聚氰胺与琥珀酰亚胺基丙醛反应得到，分子结构式为：所述荧光微球是直径为100～300nm的用聚苯乙烯包裹荧光物质的微球，其表面连接有—COOH基团，所述荧光物质为异硫氰酸荧光素。本专利技术采取的另一个技术方案是提供一种制备上述检测三聚氰胺残留的荧光微球免疫层析试纸条的方法，它包括如下步骤：1)样品结合垫的制备：用市售的荧光微球标记抗三聚氰胺单克隆抗体，并将其以特定缓冲体系稀释后，将样品结合垫浸泡于稀释缓冲液中，经真空冷冻干燥后制备；2)硝酸纤维素膜的制备：将三聚氰胺半抗原-载体蛋白偶联物喷涂到硝酸纤维素膜上的检测区范围，制成检测区；将羊抗鼠抗抗体喷涂到硝酸纤维素膜上的质控区范围，制成质控区；3)组装和剪切：在底板上依次搭接地粘贴包埋有荧光微球标记抗三聚氰胺单克隆抗体的样品结合垫、固定有检测区和质控区的硝酸纤维素膜及吸水垫，并剪切成所需的宽度即为荧光微球免疫层析试纸条。具体地说，步骤包括：1)将三聚氰胺与琥珀酰亚胺基丙醛反应，制备三聚氰胺半抗原；2)将三聚氰胺半抗原与载体蛋白偶联，制备三聚氰胺半抗原-载体蛋白偶联物；3)用三聚氰胺半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌三聚氰胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株；4)提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；5)分别将三聚氰胺半抗原-载体蛋白偶联物和羊抗鼠抗抗体喷涂到硝酸纤维素膜的检测区范围(T)和质控区范围(C)；6)将样品结合垫用含牛血清白蛋白(牛血清白蛋白在缓冲体系中的终浓度为0.5％体积百分含量)、pH7.2、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液均匀浸泡2h，37℃下烘干2h；7)用市售的荧光微球标记抗三聚氰胺单克隆抗体，并将其以特定缓冲体系稀释后，将6)处理过的样品结合垫浸泡于稀释缓冲液中，经真空冷冻干燥后备用；8)在底板上依次搭接地粘贴包埋有荧光微球标记抗三聚氰胺单克隆抗体的样品结合垫、固定有检测区和质控区的硝酸纤维素膜及吸水垫，并剪切成所需的宽度即为荧光微球免疫层析试纸条。本专利技术采取的另一个技术方案是提供一种上述检测三聚氰胺残留的荧光微球免疫层析试纸条在检测三聚氰胺中的应用，它包括如下步骤：1)样品前处理；2)用所述的检测三聚氰胺残留的荧光微球免疫层析试纸条进行检测；3)用荧光检测仪分析检测结果。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：(1)特异性强、灵敏度高：本试纸条采用将荧光微球标记的抗三聚氰胺单克隆抗体包埋在样品结合垫上，具有亲水性佳、可大容量吸附抗体偶联物、迅速重湿润、抗体结合物释放充分、性能好、释放快、形态好等优势，从而减少误差，降低成本，增加整个体系的反应灵敏度；(2)荧光微球表面包裹了聚苯乙烯，实现了对荧光物质异硫氰酸荧光素的保护，减少了外界环境的干扰，增加了荧光微球的稳定性及荧光寿命；(3)荧光微球表面修饰活性基团—COOH，采用化学偶联的方法来标记抗体，形成抗体与微球的稳定结合。附图说明图1为荧光微球免疫层析试纸条剖面结构示意图；图2为荧光微球免疫层析试纸条俯视图；图3为三聚氰胺半抗原合成路线图；图4为三聚氰胺半抗原核磁共振氢谱图。具体实施方式下面结合实施例及附图对本专利技术做进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例1检测三聚氰胺残留的荧光微球免疫层析试纸条的构成所述试纸条(图1、图2)是由底板、样品结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫组成；所述样品结合垫1、硝酸纤维素膜2和吸水垫3依次按顺序搭接粘贴在底板6上，样品结合垫的末端与硝酸纤维素膜的始端相连，硝酸纤维素膜的末端与吸水垫的始端相连，样品结合垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐；所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测三聚氰胺残留的荧光微球免疫层析试纸条，其特征在于包括底板及在底板上依次搭接粘贴的样品结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述样品结合垫上包埋有荧光微球标记的抗三聚氰胺单克隆抗体，所述硝酸纤维素膜上固定有检测区和质控区，检测区喷涂有三聚氰胺半抗原‑载体蛋白偶联物，质控区喷涂有羊抗鼠抗抗体；其中，所述三聚氰胺半抗原‑载体蛋白偶联物是由三聚氰胺半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清白蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白或人血清白蛋白，所述三聚氰胺半抗原是由三聚氰胺与琥珀酰亚胺基丙醛反应得到，分子结构式为：

【技术特征摘要】
1.一种检测三聚氰胺残留的荧光微球免疫层析试纸条，其特征在于包括底板及在底板上依次搭接粘贴的样品结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述样品结合垫上包埋有荧光微球标记的抗三聚氰胺单克隆抗体，所述硝酸纤维素膜上固定有检测区和质控区，检测区喷涂有三聚氰胺半抗原-载体蛋白偶联物，质控区喷涂有羊抗鼠抗抗体；其中，所述三聚氰胺半抗原-载体蛋白偶联物是由三聚氰胺半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清白蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白或人血清白蛋白，所述三聚氰胺半抗原是由三聚氰胺与琥珀酰亚胺基丙醛反应得到，分子结构式为：2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于所述荧光微球是直径为100～300nm的用聚苯乙烯包裹荧光物质的微球，其表面连接有—COOH基团，所述荧光物质为异硫氰酸荧光素。3.一种权利要求1-2任一项所述的检测三聚氰胺残留的荧光微球免疫层...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯才伟，何方洋，万宇平，冯静，杨昌松，崔廷婷，崔彦虎，魏力杰，
申请(专利权)人：北京勤邦生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11