一种检测椰毒假单胞菌的重组酶聚合酶恒温扩增方法、其引物探针组合物及用途技术

本发明专利技术公开了一种检测椰毒假单胞菌的重组酶聚合酶恒温扩增方法、其引物探针组合物及用途。本发明专利技术所提供的引物探针组合物由正向引物、反向引物和探针组成，所述正向引物具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述反向引物具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，所述探针具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。本发明专利技术还提供了一种检测椰毒假单胞菌的重组酶聚合酶恒温扩增方法。本发明专利技术首次采用重组酶聚合酶恒温扩增技术结合侧向层析技术建立快速检测椰毒假单胞菌的方法，具有操作简单、灵敏度高、特异性强、反应结果易于观察、安全无污染等特点，非常适用于食品安全现场检测及监控。非常适用于食品安全现场检测及监控。

【技术实现步骤摘要】
一种检测椰毒假单胞菌的重组酶聚合酶恒温扩增方法、其引物探针组合物及用途


[0001]本专利技术涉及椰毒假单胞菌的检测，具体涉及一种检测椰毒假单胞菌的重组酶聚合酶恒温 扩增方法、其引物探针组合物及用途。
技术背景
[0002]椰毒假单胞菌属于革兰氏阴性菌，易在食品表面生长，容易污染谷类发酵制品(发酵玉 米面、糯玉米汤圆粉、发酵糯小米等)、薯类制品(马铃薯粉条、甘薯淀粉、山芋淀粉等)及 变质银耳和木耳等。椰毒假单胞菌引起的食物中毒具有极高的致死率，对健康造成严重威胁， 由该菌引发食物中毒的平均死亡率可达41.8％。因此，对椰毒假单胞菌进行快速灵敏检测是 保证食品安全和人们身体健康的有效措施。
[0003]目前，检测食品中的椰毒假单胞菌的方法主要有传统培养法、快速检测法和分子检测法。 其中，传统培养法检测是国际通用认可的方法，准确性高，但培养过程周期长，易受环境及 人为因素的影响，而且生化实验繁琐，不能实现批量产品快速检测；快速检测法是利用全自 动微生物生化鉴定和基因指纹鉴定仪对椰毒假单胞菌进行鉴定，方便快速、特异性强、灵敏 度高，但存在检测出假阳性的风险；分子检测法是基于保守序列16S rRNA、23S rRNA以及 16S～23S rRNA间区序列，利用PCR(聚合酶链式反应)、产物测序分析及脉冲场凝胶电泳等 技术建立的一种检测方法，但是这些检测技术大多需要依赖后续的电泳过程，操作过程相对 繁琐，对检测人员有较高的技术要求，而且大多需要昂贵的仪器设备，所以也不适合现场快 速检测。因此急需开发新的快速简单灵敏的椰毒假单胞菌检测方法。
[0004]重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification，RPA)是2006年由英国公司 TwistDx Inc研发的一种核酸恒温扩增技术。该技术能够在15min内进行常温下的单分子核酸 检测，对硬件设备的要求很低，反应时间短，无需对样品进行复杂处理，且扩增产物可通过 侧向层析试纸条实现可视化判别，特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农 业等。
[0005]本专利技术采用重组酶聚合酶恒温扩增技术结合侧向层析技术建立快速检测椰毒假单胞菌的 方法，通过检索，尚未发现与本专利技术申请相关的专利公开文献。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种检测椰毒假单胞菌的重组酶聚合 酶恒温扩增方法、其引物探针组合物及用途，该方法具有高灵敏度、高特异性、可视化、操 作简单、便携的特点。
[0007]本专利技术是通过以下技术方案实现上述的专利技术目的：
[0008]一种检测椰毒假单胞菌的引物探针组合物，该引物探针组合物由正向引物、反向引物和 探针组成，所述正向引物具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述反向引物具有如SEQ IDNo.2所示的核苷酸序列，所述探针具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。
[0009]优选地，所述反向引物的5
’
端标记生物素Biotin；所述探针的5
’
端标记羧基荧光素FAM， 且在距羧基荧光基团40个碱基处增加一个四氢呋喃THF，3
’
端由C3spacer修饰。
[0010]优选地，各引物和探针的序列如下所示：
[0011]正向引物：TCTGCCGACGCTGCCCCATACCACCGAGCAGT
[0012]反向引物：[Biotin]‑
ATGGTCCGTATCTCCTGCTTGTGCGCCTCGAA
[0013]探针：[6FAM]‑
CCGCGACAGGTTCCAGTGCCATTACGTGCCGCAGGATGCC
‑
[THF]‑
GG CCGAAGCTGCTGAAGGA
‑
[C3spacer][0014]上述的引物探针组合物在检测椰毒假单胞菌中的应用。
[0015]一种检测椰毒假单胞菌的重组酶聚合酶恒温扩增方法，包括：以待测样品的基因组DNA 为反应模板，采用上述的引物探针组合物进行重组酶聚合酶扩增，然后使用侧向层析核酸检 测试纸条检测扩增产物，判断检测结果，当检测线和质控线上都出现红色条带时，表示待测 病菌为椰毒假单胞菌。
[0016]优选地，所述检测椰毒假单胞菌的重组酶聚合酶恒温扩增方法，具体步骤如下：
[0017](1)扩增试剂准备和加样：将10μmol/L正向引物2.0μL、10μmol/L反向引物2.0μL、 5μmol/L探针0.6μL、2.5μL待测样品、10.9μL ddH2O和29.5μL缓冲液组成预混液，加到含有 冻干酶粉的0.2mL的TwistAmp nfo反应管中。然后将2.5μL的醋酸镁溶液加到反应液中，充 分混匀。
[0018](2)扩增：将充分混匀后的溶液37℃扩增20min，在反应第4min，将反应管取出充分 混匀，之后放回反应装置中继续扩增。
[0019](3)结果判断：取10μL的RPA扩增产物加入190μL展开剂混合均匀，再取50μL混匀 液用侧向层析核酸检测试纸条进行检测，检测线和质控线均显出，判断结果为阳性；检测线 未显出，质控线显出，判断结果为阴性；质控线未显出，不管检测线是否显出，均判定结果 无效。
[0020]本专利技术检测椰毒假单胞菌的重组酶聚合酶恒温扩增方法，其原理是采用重组酶聚合酶恒 温扩增技术，对椰毒假单胞菌的特异性基因保守区域，即椰毒假单胞菌的产毒基因簇bon进 行检测，该序列可作为椰毒假单胞菌的标志基因之一。侧向层析核酸检测试纸条样品端携带 有标记抗FAM荧光基团抗体的胶体金颗粒，NC膜的检测线上包被抗生物素抗体，质控线上 包被抗FAM的抗抗体。利用生物素标记的引物和FAM标记的探针对目的基因扩增后，将扩 增液滴入试纸条样品端，在检测线上会形成生物素抗体
‑
核酸
‑
胶体金复合体而呈现暗红色条 带。因此，反应结束后通过侧向层析试纸条上检测线的颜色变化，来判断椰毒假单胞菌的有 无。
[0021]本专利技术与现有技术相比，其优点和积极效果表现在：
[0022](1)检测速度快：本专利技术用于检测椰毒假单胞菌的重组酶聚合酶恒温扩增方法，可在 37℃下20min内完成扩增，整个检测过程可在1h内完成。与常规PCR和实时荧光定量PCR 需要数小时相比，极大地缩短了检测时间。
[0023](2)操作简便：本专利技术用于检测椰毒假单胞菌的重组酶聚合酶恒温扩增方法，只需要恒 温37℃即可完成实验，该温度远远低于荧光定量PCR的60～95℃以及环介导等温扩增技术 (LAMP)的63℃，摆脱了对热循环仪器和稳定热源的依赖，极大地扩展了其使用范围。
[0024](3)灵敏度高，特异性强：本专利技术用于检测椰毒假单胞菌的重组酶聚合酶恒温扩增
方法， 灵敏度高，最低检出量可达到10～102copies/μL；特异性强，与其他菌属均不发生交叉反应。
[0025](4)易于推广本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测椰毒假单胞菌的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物由正向引物、反向引物和探针组成，所述正向引物具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述反向引物具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，所述探针具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，所述反向引物的5
’
端标记生物素Biotin；所述探针的5
’
端标记羧基荧光素FAM，且在距羧基荧光基团40个碱基处增加一...

【专利技术属性】
技术研发人员：牛晨，岳田利，宋玺英，盛庆林，张瑜，吴小胜，凡静静，
申请(专利权)人：北京勤邦生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：