一种检测多种牛乳腺炎病原的引物对和探针组合及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种检测多种牛乳腺炎病原的引物对和探针组合，所述引物对和探针分别针对金黄色葡萄球菌rpoB基因、链球菌tuf基因、牛支原体oppD/F基因、产色葡萄球菌sodA基因、大肠杆菌79号基因，序列如SEQ ID NO:1

【技术实现步骤摘要】
一种检测多种牛乳腺炎病原的引物对和探针组合及其应用


[0001]本专利技术属于病原检测领域，涉及一种用于检测牛乳腺炎病原的引物对和探针组合，本专利技术还涉及所述引物对和探针组合的应用以及一种非诊断目的检测多种牛乳腺炎病原的TaqMan实时荧光定量PCR方法。

技术介绍

[0002]牛乳腺炎是制约全球奶牛养殖业发展的最重要疾病之一，不仅造成巨大经济损失，包括牛奶产量减少、牛奶质量下降以及额外的治疗和处理成本，治疗时抗生素滥用及多耐药菌产生严重威胁公共卫生安全威胁。在全球范围内，奶牛临床型乳腺炎发病率约为30％，亚临床型乳腺炎患病率为15％
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75％(Molineri et al.,Prev Vet Med,2021,188:105261)。引起牛乳腺炎的病原菌种类较多，在我国，金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌、牛支原体、产色葡萄球菌、大肠杆菌，它们引起了绝大多数的牛乳腺炎(Song X et al.,Veterinary Microbiology,2020,247:108757；Liu Y et al.,Prev Vet Med,2020,182:105106)。准确鉴定牛乳腺炎病原菌，有利于早期发现与及时治疗。
[0003]目前国内奶牛乳腺炎发病率高，且缺乏准确高效诊断方法。常用的微生物培养法被认为是“金标准”，但是存在耗时长(5
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7天)、准确度低及对操作人员要求高的缺点；血清学检测方法如ELISA、免疫胶体金技术等则存在诊断“窗口期”，动物机体产生相应的检测靶标需要一定周期；普通PCR应用最为广泛，但扩增后需要电泳及测序才能得到结果。
[0004]由于在奶牛乳腺炎诊断领域缺乏单管多重病原一次性检测方法，而荧光定量PCR已广泛用于动物病原检测，基于该技术可实现多病原、结果可视化检测。因此本研究将检测临床需要与方法结合，建立一种可以检测牛乳腺炎七种主要病原的TaqMan荧光定量PCR方法，填补实验室奶牛乳腺炎病原检测以及临床应用的空白，具有较大的经济效益与社会效益。

技术实现思路

[0005]本专利技术为解决目前牛乳腺炎病原检测操作复杂的难题，提供了一种检测多种牛乳腺炎病原的引物对和探针组合，本专利技术提供的引物对和探针组合能够对临床奶样或其它样本中的金黄色葡萄球菌、链球菌(无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌)、牛支原体、产色葡萄球菌、大肠杆菌同时进行检测，不仅能提高检测效率，而且还具有较高的灵敏度和特异性。
[0006]本专利技术提供的引物对和探针组合分别针对金黄色葡萄球菌rpoB基因、链球菌tuf基因、牛支原体oppD/F基因、产色葡萄球菌sodA基因、大肠杆菌79号基因进行设计，其中，
[0007]针对金黄色葡萄球菌rpoB基因的引物对序列如SEQ ID NO:1
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2所示，探针序列如SEQ ID NO:3所示；
[0008]针对链球菌tuf基因的引物对序列如SEQ ID NO:4
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5所示，探针序列如SEQ ID NO:6所示；
[0009]针对牛支原体oppD/F基因的引物对序列如SEQ ID NO:7
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8所示，探针序列如SEQ ID NO:9所示；
[0010]针对产色葡萄球菌sodA基因的引物对序列如SEQ ID NO:10
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11所示，探针序列如SEQ ID NO:12所示；
[0011]针对大肠杆菌79号基因的引物对序列如SEQ ID NO:13
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14所示，探针序列如SEQ ID NO:15所示。
[0012]其中，所述探针的5
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端标记报告基团，3
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端标记猝灭基团。
[0013]优选地，用于检测金黄色葡萄球菌的探针5
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端标记的报告基团是FAM，3
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端标记的猝灭基团是BHQ1；用于检测链球菌的探针5
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端标记的报告基团是VIC，3
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端标记的猝灭基团是BHQ1；用于检测牛支原体的探针5
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端标记的报告基团是CY5，3
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端标记的猝灭基团是BHQ2；用于检测产色葡萄球菌的探针5
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端标记的报告基团是Texas red，3
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端标记的猝灭基团是BHQ2；用于检测大肠杆菌的探针5
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端标记的报告基团是CY5.5，3
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端标记的猝灭基团是BHQ3。
[0014]本专利技术的另一目的是提供所述的引物对和探针组合在检测多种牛乳腺炎病原中的应用，所述多种牛乳腺炎病原是金黄色葡萄球菌、链球菌、牛支原体、产色葡萄球菌、大肠杆菌。该应用不仅能对牛乳腺炎进行疾病诊断，而且也能用于非诊断目的的牛乳腺炎病原实验室筛查、鉴定，以及食品安全检查等。
[0015]其中，所述链球菌是无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌。
[0016]本专利技术的第三个目的是提供一种检测多种牛乳腺炎病原的试剂盒，该试剂盒包含以上所述的引物对和探针组合。
[0017]本专利技术的第四个目的是提供一种非诊断目的检测多种牛乳腺炎病原的TaqMan实时荧光定量PCR方法，该方法包括以检测样品为模板，加入反应液、超纯水和以上所述的引物对和探针组合并进行PCR扩增的步骤。
[0018]优选地，所述PCR扩增体系为：2
×
Probe PCR Master Mix 10μL；金黄色葡萄球菌上下游引物终浓度均为450nmol/L、探针终浓度为175nmol/L；链球菌上下游引物终浓度均为450nmol/L、探针终浓度为125nmol/L；牛支原体上下游引物终浓度均为400nmol/L、探针终浓度为175nmol/L；产色葡萄球菌上下游引物终浓度均为400nmol/L、探针终浓度为125nmol/L；大肠杆菌上下游引物终浓度均为400nnol/L、探针终浓度为200nmol/L；模板5μL，ddH2O补足至20μL。
[0019]优选地，所述PCR扩增程序为，37℃污染消化2min；95℃预变性30s，1个循环；95℃10s，56.7℃退火30s，40个循环。
[0020]本专利技术的有益效果是：
[0021](1)便利性。本专利技术可单管一次性对牛乳腺炎7种病原进行检测，不需要分别设计引物进行PCR扩增，而且根据反应后的Ct值即可实现病原的定性和定量，不需要再对扩增产物进行电泳检测，因此大幅提高了检测效率。
[0022](2)灵敏度。本专利技术建立的方法对重组质粒的检测灵敏度分别为金黄色葡萄球菌101copies/μL，链球菌101copies/μL，牛支原体102copies/μL，产色葡萄球菌101copies/μL，大肠杆菌101copies/μL。通过与普通PCR方法比较，本专利技术建立的方法检测灵敏度更高。
[0023](3)特异性。本专利技术建立的方法进行qPCR扩增时，金黄色葡萄球菌、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测多种牛乳腺炎病原的引物对和探针组合，其特征在于：所述多种牛乳腺炎病原是金黄色葡萄球菌、链球菌、牛支原体、产色葡萄球菌、大肠杆菌，所述引物对和探针分别针对金黄色葡萄球菌rpoB基因、链球菌tuf基因、牛支原体oppD/F基因、产色葡萄球菌sodA基因、大肠杆菌79号基因，其中，针对金黄色葡萄球菌rpoB基因的引物对序列如SEQ ID NO:1
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2所示，探针序列如SEQ ID NO:3所示；针对链球菌tuf基因的引物对序列如SEQ ID NO:4
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5所示，探针序列如SEQ ID NO:6所示；针对牛支原体oppD/F基因的引物对序列如SEQ ID NO:7
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8所示，探针序列如SEQ ID NO:9所示；针对产色葡萄球菌sodA基因的引物对序列如SEQ ID NO:10
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11所示，探针序列如SEQ ID NO:12所示；针对大肠杆菌79号基因的引物对序列如SEQ ID NO:13
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14所示，探针序列如SEQ ID NO:15所示。2.如权利要求1所述的引物对和探针组合，其特征在于：所述探针的5
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端标记报告基团，3
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端标记猝灭基团。3.如权利要求2所述的引物对和探针组合，其特征在于：针对金黄色葡萄球菌rpoB基因的探针5
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端标记的报告基团是FAM，3
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端标记的猝灭基团是BHQ1；针对链球菌tuf基因的探针5
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端标记的报告基团是VIC，3
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端标记的猝灭基团是BHQ1；针对牛支原体oppD/F基因的探针5
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端标记的报告基团是CY5，3
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端标记的猝灭基团是BHQ2；针对产色葡萄球菌sodA基因的探针5
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端标记的报告基团是Texas red，3
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端标记的猝...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡长敏，李政志，郭爱珍，陈颖钰，陈曦，陈建国，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：