一种五氯硝基苯人工抗原在酶联免疫试剂盒中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种检测五氯硝基苯的酶联免疫试剂盒，它包括：包被有包被原的酶标板、五氯硝基苯标准品溶液、五氯硝基苯抗体、酶结合物浓缩液、酶结合物稀释液、底物显色液、终止液、洗涤液，所述包被原为五氯硝基苯偶联抗原，所述酶结合物为酶标记的五氯硝基苯抗体，所述五氯硝基苯抗体是由免疫原免疫动物得到的。本发明专利技术还公开了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测五氯硝基苯的方法，它包括：首先进行样品前处理，然后用试剂盒进行检测，最后分析检测结果。本发明专利技术提供的酶联免疫试剂盒可用于检测南美白对虾样本中五氯硝基苯的含量，其操作简便、费用低廉、灵敏度高、能够现场监控且适合大量样本的筛查。

【技术实现步骤摘要】
一种五氯硝基苯人工抗原在酶联免疫试剂盒中的应用
本专利技术涉及一种五氯硝基苯人工抗原在酶联免疫试剂盒中的应用技术，具体涉及一种五氯硝基苯人工抗原分子结构以及用于检测五氯硝基苯的酶联免疫试剂盒，可定性、定量检测南美白对虾中五氯硝基苯药物的残留量。
技术介绍
五氯硝基苯属有机氯保护性杀菌剂，不溶于水，溶于有机溶剂，化学性质稳定，不易挥发、氧化和分解，也不易受阳光和酸碱的影响，但在高温干燥的条件下会爆炸分解，降低药效。对人、畜、鱼低毒，在土壤残效期长。五氯硝基苯的使用安全性问题已经在世界各国引起了广泛关注。欧盟和美国均已出台了禁用或限制使用范围的措施，但国内更多的工作是针对五氯硝基苯在不同样品中检出的分析方法的研究。为了保证粮食的增产丰收和保护生态环境安全，在我国目前条件下虽没有禁止五氯硝基苯的使用，但应对五氯硝基苯导致的环境问题引起高度重视，逐步采取相应的监督管理措施。检测五氯硝基苯的方法有气相色谱法、气相色谱-质谱法等，与上述方法相比，免疫化学检测法对药物检测具有快速、特异、灵敏、准确、可以批量监测、样品处理简单、能实现自动化操作等优点。而免疫化学法检测五氯硝基苯的前提是需要具备针对五氯硝基苯的抗体，本申请专利技术了五氯硝基苯人工抗原制备方法，并将其应用于酶联免疫试剂盒中，用时短，操作简单，成本较低，适用于基层单位大批量地检测样品。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能够检测南美白对虾中五氯硝基苯药物残留量的酶联免疫试剂盒，并提供一种高效、准确、简便、适于大批量样品筛选的定性、定量检测方法。本专利技术试剂盒，它包括：包被有包被原的酶标板、五氯硝基苯标准品溶液、五氯硝基苯抗体、酶结合物浓缩液、酶结合物稀释液、底物显色液、终止液、洗涤液，所述包被原为五氯硝基苯偶联抗原，所述酶结合物为酶标记的五氯硝基苯抗体。所述五氯硝基苯特异性抗体是以一种五氯硝基苯人工抗原作为免疫原制备获得，所述五氯硝基苯特异性抗体可为五氯硝基苯单克隆抗体或五氯硝基苯多克隆抗体，其中优选五氯硝基苯单克隆抗体。所述酶结合物的标记酶为辣根过氧化物酶或细菌提取碱性磷酸酯酶，其中优选辣根过氧化物酶；酶结合物是由酶和五氯硝基苯抗体偶联得到的。为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括五氯硝基苯标准品溶液、底物显色液、终止液、洗涤液。所述五氯硝基苯标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L，0.1μg/L，0.3μg/L，0.9μg/L，2.7μg/L，8.1μg/L。当标记酶为辣根过氧化物酶时，所述底物显色液由底物液A液和底物液B液组成，A为过氧化氢或过氧化脲，B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，所述终止液为1～2mol/L的硫酸溶液或盐酸缓冲液；当标记酶为细菌提取碱性磷酸酯酶时，所述底物显色液为对硝基磷酸盐缓冲液，所述终止液为1～2mol/L氢氧化钠溶液。所述洗涤液优选为pH值为7.4，含有0.5％～1.0％吐温-20、0.01‰～0.03‰叠氮化钠防腐剂、0.1～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。其中在酶标板制备过程中所用到的包被缓冲液为pH值为9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，封闭液为pH值为7.1～7.5，含有1％～3％酪蛋白、0.1～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。本专利技术中酶标板的制备过程为：用包被缓冲液将包被原稀释成20μg/mL，每孔加入100μl，25℃避光孵育2h或4℃过夜，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入150～200μl封闭液，25℃避光孵育1～2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。本专利技术的检测原理为：本试剂盒采用ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的五氯硝基苯和酶标板微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗五氯硝基苯的酶结合物，用TMB底物显色，样本吸光度值与其所含残留物五氯硝基苯的含量成负相关，与标准曲线比较，再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样本中五氯硝基苯的残留量。本专利技术还提供了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测五氯硝基苯的方法，它包括步骤：(1)用试剂盒进行检测；(2)分析检测结果。本专利技术检测五氯硝基苯的酶联免疫试剂盒主要采用ELISA方法定性或定量检测样品中五氯硝基苯的含量；对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批量样品；主要试剂以工作液的形式提供，检验方法方便易行，具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。本专利技术的酶联免疫试剂盒，结构简单、使用方便、价格便宜、携带便利、检测方法高效、准确、简便、适于大批量样品筛选的定性、定量。附图说明图1：五氯硝基苯半抗原的分子结构式图2：五氯硝基苯半抗原的合成路线图具体实施方式下面结合具体的实施例来进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术，而不用来限制本专利技术的范围。实施例1试剂盒组分的制备1、五氯硝基苯半抗原的制备取1.3-二氯-5-碘-2-硝基苯3.16g，加无水乙醇100ml溶解，滴加含有2.4g羧甲基羟胺的水溶液15ml，加甲醇钠1.08g，加热回流反应4h，停止反应，旋蒸，除去乙醇，加水100ml，用1mol/L盐酸，调节PH值到6，加乙酸乙酯100ml×3，萃取三次，合并有机相，蒸干，上硅胶柱，石油醚/乙酸乙酯(v/v,1/1)洗脱分离，得到羧基邻二氯硝基苯半抗原产物2.3g，收率82.4％。2、抗原的制备免疫原制备——五氯硝基苯半抗原与牛血清白蛋白(BSA)偶联得到免疫原。取羧基邻二氯硝基苯11mg，加1mlDMSO溶解澄清，加NHS6.7mg，EDC9.7mg，充分溶解混匀，室温反应2h，得到半抗原活化液A液；取牛血清白蛋白(BSA)50mg，加0.1MCB9.56ml溶解，得到B液，将A液逐滴滴加到B液中，室温反应4h，停止反应，0.02MPBS透析纯化3天，每天换液3次，离心分装，得到羧基邻二氯硝基苯-BSA偶联物，即为免疫原。包被原制备——五氯硝基苯半抗原与卵清蛋白(OVA)偶联得到包被原。取羧基邻二氯硝基苯9mg，加1mlDMSO溶解澄清，加NHS5.4mg，EDC8.2mg，充分溶解混匀，室温反应2h，得到半抗原活化液A液；取卵清白蛋白(OVA)50mg，加0.1MCB9.56ml溶解，得到B液，将A液逐滴滴加到B液中，室温反应4h，停止反应，0.02MPBS透析纯化3天，每天换液3次，离心分装，得到羧基邻二氯硝基苯-OVA偶联物，即为包被原。本文以1.3-二氯-5-碘-2-硝基苯为原料，与羧甲基羟胺在甲醇钠催化的条件下，通过与苯环上的碘进行亲核取代反应，从而合成五氯硝基苯特有的结构片段，偶联蛋白进行免疫，制备针对五氯硝基苯的特异性抗体。3、五氯硝基苯单克隆抗体的制备动物免疫：将上述步骤得到的免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生抗血清。细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测五氯硝基苯的酶联免疫试剂盒，其特征在于包括：包被有包被原的酶标板、五氯硝基苯标准品溶液、五氯硝基苯抗体、酶结合物浓缩液、酶结合物稀释液、底物显色液、终止液、洗涤液，所述包被原为五氯硝基苯偶联抗原，所述酶结合物为酶标记的五氯硝基苯抗体，所述五氯硝基苯抗体是由免疫原免疫动物得到的，所述五氯硝基苯偶联抗原是由五氯硝基苯半抗原与载体蛋白偶联得到，所述五氯硝基苯半抗原是由1.3-二氯-5-碘-2-硝基苯与羧甲基羟胺等物质经过一系列化学反应得到的。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测五氯硝基苯的酶联免疫试剂盒，其特征在于包括：包被有包被原的酶标板、五氯硝基苯标准品溶液、五氯硝基苯抗体、酶结合物浓缩液、酶结合物稀释液、底物显色液、终止液、洗涤液，所述包被原为五氯硝基苯偶联抗原，所述酶结合物为酶标记的五氯硝基苯抗体，所述五氯硝基苯抗体是由免疫原免疫动物得到的，所述五氯硝基苯偶联抗原是由五氯硝基苯半抗原与载体蛋白偶联得到，所述五氯硝基苯半抗原是由1.3-二氯-5-碘-2-硝基苯与羧甲基羟胺等物质经过一系列化学反应得到的。


2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述五氯硝基苯半抗原的分子结构式为：





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【专利技术属性】
技术研发人员：马玉华，周鑫，贾芳芳，何方洋，项爱丽，崔海峰，郑百芹，
申请(专利权)人：北京勤邦生物技术有限公司，唐山市食品药品综合检验检测中心，
类型：发明
国别省市：北京;11