一种用于检测I型骨质疏松症的蛋白芯片及其制作方法与应用技术

本发明专利技术属于生物检测领域，具体的属于一种用于检测I型骨质疏松症的蛋白芯片及其制作方法与应用。本发明专利技术基于iTRAQ蛋白定量组学分析I型骨质疏松症患者血清和外周血单核细胞中差异蛋白。iTRAQ蛋白定量技术具有灵敏性高，可同时执行多个样本的检测，避免了多次质谱之间的组间差异。因此，本发明专利技术筛选的I型骨质疏松症患者中的候选差异蛋白具有高度可信性。本发明专利技术所需样本量极少，有高的信噪比，高准确性、灵敏性；快速、微型化和自动化，可通过标准曲线进行定量检测；因此，本发明专利技术研发的产品将大大提高临床诊断I型骨质疏松症患者的准确率及效率，具有很强的应用创新性及十分重要的临床研究意义。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测I型骨质疏松症的蛋白芯片及其制作方法与应用
本专利技术属于生物检测领域，具体的属于一种用于检测I型骨质疏松症的蛋白芯片及其制作方法与应用。
技术介绍
随着社会经济的发展和生活水平的提高，我国已逐渐进入老龄化社会，骨质疏松的患病率逐年增加。我国老年人骨质疏松的患病率女性为90%,男性为61%，在全世界居常见病第六位。WHO认为骨质疏松症为心血管疾病之后,第二大致死的健康照顾问题。该疾病所导致的骨痛、骨病甚至骨折严重降低了中老年人的生活质量，且大大增加了患者的医疗费用,因而备受医疗和科研人员的重视。骨质疏松即骨质疏松症，是多种原因引起的一组骨病，骨组织有正常的钙化，钙盐与基质呈正常比例，以单位体积内骨组织量减少为特点的代谢性骨病变。在多数骨质疏松中，骨组织的减少主要由于骨质吸收增多所致。以骨骼疼痛、易于骨折为特征。临床表现为疼痛，原发性骨质疏松症最常见的症状，以腰背痛多见，占疼痛患者中的70％～80％。疼痛沿脊柱向两侧扩散，仰卧或坐位时疼痛减轻，直立时后伸或久立、久坐时疼痛加剧，弯腰、咳嗽、大便用力时加重。一般骨量丢失12％以上时即可出现骨痛。老年骨质疏松症时，椎体压缩变形，脊柱前屈，肌肉疲劳甚至痉挛，产生疼痛。新近胸腰椎压缩性骨折，亦可产生急性疼痛，相应部位的脊柱棘突可有强烈压痛及叩击痛。若压迫相应的脊神经可产生四肢放射痛、双下肢感觉运动障碍、肋间神经痛、胸骨后疼痛类似心绞痛。若压迫脊髓、马尾神经还影响膀胱、直肠功能。退行性骨质疏松症最常见和最严重的并发症。骨质疏松的检查在实验室层面上主要是如下几点:(1)血钙、磷和碱性磷酸酶在原发性骨质疏松症中，血清钙、磷以及碱性磷酸酶水平通常是正常的，骨折后数月碱性磷酸酶水平可增高。(2)血甲状旁腺激素应检查甲状旁腺功能除外继发性骨质疏松症。原发性骨质疏松症者血甲状旁腺激素水平可正常或升高。(3)骨更新的标记物骨质疏松症患者部分血清学生化指标可以反应骨转换(包括骨形成和骨吸收)状态，这些生化测量指标包括：骨特异的碱性磷酸酶(反应骨形成)、抗酒石酸酸性磷酸酶(反应骨吸收)、骨钙素(反应骨形成)、Ⅰ型原胶原肽(反应骨形成)、尿吡啶啉和脱氧吡啶啉(反应骨吸收)、Ⅰ型胶原的N-C-末端交联肽(反应骨吸收)。(4)晨尿钙/肌酐比值正常比值为0.13±0.01，尿钙排量过多则比值增高，提示有骨吸收率增加可能。其次是辅助检查，又分为以下几个方面，骨影像学检查和骨密度①摄取病变部位的X线片X线可以发现骨折以及其他病变，如骨关节炎、椎间盘疾病以及脊椎前移。骨质减少(低骨密度)摄片时可见骨透亮度增加，骨小梁减少及其间隙增宽，横行骨小梁消失，骨结构模糊，但通常需在骨量下降30％以上才能观察到。大体上可见椎体双凹变形，椎体前缘塌陷呈楔形变，亦称压缩性骨折，常见于第11、12胸椎和第1、2腰椎。②骨密度检测骨密度检测是骨折的预测指标。测量何部位的骨密度，可以用来评估总体的骨折发生危险度；测量特定部位的骨密度可以预测局部的骨折发生的危险性。在现有技术中，CN102534019A公开了一种试剂盒通过检测与骨质疏松症发生密切相关的5个单核苷酸多态性位点的基因型来筛查出容易患骨质疏松症的女性高危人群，并最终根据每一位受检者的基因检测结果从基因层面评估骨质疏松症易感的风险级别，指导更年期女性针对性的有效预防骨质疏松症的发生。近年来，对骨质疏松的诊断和检测的研究已渐深入。目前骨质疏松症检测方法主要只有骨密度包括双能x线，超声骨密度和腰椎定量CT(QCT)等，临床上没有直接检测血清方法，只有通过骨生化标志物（骨形成指标和骨破坏指标）来进行综合的判定。蛋白芯片是一种高通量的蛋白功能分析技术，是近年发展起来的一项生物检测技术。利用这项技术，通过将大量抗体或抗原密集地点制在固相载体上，具有可同时检测多种蛋白质且样本需求量小的特点，对于高通量基因表达的研究具有非常重要的意义。但是，目前未见有关I型骨质疏松症的临床血清蛋白芯片检测产品。
技术实现思路
本专利技术的目的在于为了解决目前未见有关I型骨质疏松症的临床血清蛋白芯片检测产品，而提供一种用于检测I型骨质疏松症的蛋白芯片。本专利技术的第二个目的是提供了该蛋白芯片的制作方法。本专利技术的第三个目的是提供了该蛋白芯片的应用。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种用于检测I型骨质疏松症的蛋白芯片，包括固相载体和阵列式分布于固相载体上的差异蛋白抗体，所述差异蛋白抗体包括：显著下调蛋白Cystatin-B与Leucine-richalpha-2-glycoprotein、显著上调蛋白Calmodulin与Talin-1、Gla、IFN-γ、RAB7A、TSP1、GAS6、PINP及NMID。差异蛋白筛选：获取正常和绝经后骨质疏松症（I型）患者血清及外周血单核细胞，基于iTRAQ蛋白质组学定量分析技术筛选I型骨质疏松症差异蛋白；层聚类及GO富集分析确定I型骨质疏松症差异蛋白表达趋势及其参与的胞内主要生物途径；KEGG通路注释确定差异蛋白参与调控的信号通路及蛋白互作网络；结合iTRAQ筛选蛋白差异比率及文献报道，初步确定一些和骨质疏松、骨代谢等相关候选差异蛋白及与关键候选蛋白存在高度互作的蛋白分子；差异蛋白验证：结合ELISA实验，在受试样本中验证候选差异蛋白。前期基于iTRAQ专利技术人已经筛选到1321个差异蛋白，经过两步精准筛查（≥1.5倍以及≤0.8且p<0.01；结合文献调查），确定了四个显著性变化的蛋白：1）下调：Cystatin-B和Leucine-richalpha-2-glycoprotein（LRG1），它们均与促进骨形成和抑制骨吸收相关；2）上调：Calmodulin和Talin-1，均与促进破骨细胞的分化形成及骨吸收相关；为了蛋白芯片检测准确性和覆盖面广的特性，专利技术人扩大检索范围。基于数据库检索及分析结果，选取处于比值≥1.5倍以及≤0.6倍且p<0.05的差异蛋白；结合文献报道，进一步确定骨质疏松、骨代谢等相关的蛋白质，且差异处于≥1.5以及≤0.6范围（p<0.05）的差异蛋白，初步确定候选差异蛋白。同时，检测蛋白芯片中还加入经文献调研确定的一些I型骨质疏松症的血清蛋白标志物，例如：血清基质蛋白Gla、IFN-γ、RAB7A、TSP1、GAS6、、PINP及NMID。作为优选，所述蛋白芯片还包括阳性对照和阴性对照作为优选，所述固相载体为玻璃载片、滴定板或滤膜。作为优选，所述蛋白芯片是分别将差异蛋白抗体、阳性对照和阴性对照利用点制基因微阵列商品化点样仪或喷膜法点制到固相载体上。作为优选，所述差异蛋白抗体、阳性对照和阴性对照点样3-5个重复。一种用于检测I型骨质疏松症的蛋白芯片的制作方法，所述制作方法包括以下步骤：1）固相载体及其处理：使用琼脂糖膜处理固相载体，所述固相载体上设置有阴性控制孔与阳性控制孔；2）蛋白质预处理：将差异蛋白抗体溶解；3）点制微阵列：将步骤2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测I型骨质疏松症的蛋白芯片，其特征在于，包括固相载体和阵列式分布于固相载体上的差异蛋白抗体，所述差异蛋白抗体包括：显著下调蛋白Cystatin-B与Leucine-richalpha-2-glycoprotein、显著上调蛋白Calmodulin与Talin-1、Gla、IFN-γ、RAB7A、TSP1、GAS6、PINP及NMID。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测I型骨质疏松症的蛋白芯片，其特征在于，包括固相载体和阵列式分布于固相载体上的差异蛋白抗体，所述差异蛋白抗体包括：显著下调蛋白Cystatin-B与Leucine-richalpha-2-glycoprotein、显著上调蛋白Calmodulin与Talin-1、Gla、IFN-γ、RAB7A、TSP1、GAS6、PINP及NMID。


2.根据权利要求1所述的一种用于检测I型骨质疏松症的蛋白芯片，其特征在于，所述蛋白芯片还包括阳性对照和阴性对照。


3.根据权利要求1所述的一种用于检测I型骨质疏松症的蛋白芯片，其特征在于，所述固相载体为玻璃载片、滴定板或滤膜。


4.根据权利要求1或2或3所述的一种用于检测I型骨质疏松症的蛋白芯片，其特征在于，所述蛋白芯片是分别将差异蛋白抗体、阳性对照和阴性对照利用点制基因微阵列商品化点样仪或喷膜法点制到固相载体上。


5.根据权利要求4所述的一种用于检测I型骨质疏松症的蛋白芯片，其特征在于，所述差异蛋白抗体、阳性对照和阴性对照点样3-5个重复。


6.一种用于检测I型骨质疏松症的蛋白芯片的制作方法，其特征在于，所述制作方法包括以下步骤：
1）固相载体及其处理：使用琼脂糖膜处理固相载体，所述固相载体上设置有阴性控制孔与阳性控制孔；
2）蛋白质预处理：将差异蛋白抗体溶解；
3...

【专利技术属性】
技术研发人员：史晓林，
申请(专利权)人：浙江中医药大学附属第二医院，
类型：发明
国别省市：浙江;33