一种基于葡聚糖的HRP-羊抗鼠IgG标记抗体及其制备方法技术

本发明专利技术提出了一种基于葡聚糖的HRP‑羊抗鼠IgG标记抗体及其制备方法，所述方法包括，先制备环氧修饰葡聚糖，利用羊抗鼠IgG与HRP酶混合在碱性碳酸钠水溶液中与环氧修饰葡聚糖偶联反应，经过纯化、透析以及防腐处理后，得到基于葡聚糖偶联的HRP‑羊抗鼠IgG标记抗体，本发明专利技术的标记抗体相比现有技术的商品化abcam高灵敏度的正常标记HRP‑羊抗鼠igG具有更高的灵敏性，可以避免检测不准确和灵敏度低的问题，具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种基于葡聚糖的HRP-羊抗鼠IgG标记抗体及其制备方法
本专利技术涉及生物检测
，尤其涉及一种基于葡聚糖的HRP-羊抗鼠IgG标记抗体及其制备方法。
技术介绍
随着生物技术的突飞猛进，不同的领域衍生了多种不同的检测手段，包括核酸检测、蛋白浓度检测、有害化学物质检测、生物传感器等，这些检测的主要原理是通过分子或者蛋白靶点相互特异性检测后，再通过指示器进行信号显示，根据标准品浓度对应的强度信号来绘制标准曲线，从而做到对待检测物质的定量分析。这些通过化学物质本身输出信号或者通过固定的酶催化输出信号，化学物质或者酶需要通过化学偶联的方法结合到检测组分的结构上，常用的结合方法非常直接，一般利用化学物质本身的活泼基团来进行结合，但因为受限于被标记物质本身的大小以及活泼基团的数量，偶联的发光化合物或酶的数量有限，输出的信号也很低，当被检测物质的含量极低时，信号往往检测不到，这就大大限制了检测结果的准确性。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提出了一种能够大幅度提高检测结果准确性的基于葡聚糖的HRP-羊抗鼠IgG标记抗体及其制备方法。本专利技术的技术方案是这样实现的：本专利技术提供了一种基于葡聚糖的HRP-羊抗鼠IgG标记抗体的制备方法，包括如下步骤：步骤一、将羊抗鼠IgG与HRP酶混合配置成总蛋白浓度为0.5-1.5mg/ml的50-150mM碳酸钠水溶液；步骤二、向步骤一所得碳酸钠水溶液中添加环氧修饰葡聚糖，并调节pH值为10-11，在37-45℃下反应1±0.5h，然后添加羟胺，保持37-45℃反应10-50min，用于封闭未反应的环氧基，得到含有偶联羊抗鼠IgG和HRP酶的环氧修饰葡聚糖的混合溶液；步骤三、采用葡聚糖G50作为分子筛填料，对步骤二所得含有偶联羊抗鼠IgG和HRP酶的环氧修饰葡聚糖的混合溶液进行柱层析纯化，使用核酸蛋白检测仪对层析柱底部流出的产物进行检测，同时配合自动部分收集器，按照出峰顺序收集产物；步骤四、将步骤三所收集的不同产物分别装入截留分子量为2000-4000D的透析袋中，使用PBS作为透析液，在3-5℃下透析8-12h，得到透析产物；步骤五、使用分光光度计测试透析产物的蛋白浓度，加水稀释控制浓度为0.1-0.5mg/ml，并添加1-2％的牛血清蛋白，50％的甘油和0.1-1％的防腐剂，在-15--25℃下保存，得到基于葡聚糖的HRP-羊抗鼠IgG标记抗体。在以上技术方案的基础上，优选的，步骤一中，所述羊抗鼠IgG与HRP酶的质量比为1：(10-100)。在以上技术方案的基础上，优选的，步骤二中，所述环氧修饰葡聚糖的制备方法包括：选择分子量为3500-20000D的葡聚糖，配置质量浓度为1-10％的葡聚糖水溶液，采用100mM的碳酸钠溶液调整葡聚糖溶液的pH值为11-12，然后添加环氧氯丙烷，在3-5℃下反应6-8h，反应完毕，用盐酸调节反应体系的pH值为2-4，调节完毕，将产物溶液用分子截留量1000D的透析袋进行透析，采用10倍体积的pH3.0的10mM柠檬酸作为透析液，每4h更换一次透析液，共更换3次，透析后得到环氧修饰葡聚糖溶液，对环氧修饰葡聚糖溶液冷冻干燥得到环氧修饰葡聚糖。在以上技术方案的基础上，优选的，所述盐酸的浓度不超过50mM。在以上技术方案的基础上，优选的，所述环氧氯丙烷的用量为pH值为11-12的葡聚糖溶液质量的1-10％。在以上技术方案的基础上，优选的，步骤二中，所述环氧修饰葡聚糖的添加量为碳酸钠水溶液的总质量的0.1-1％。在以上技术方案的基础上，优选的，步骤二中，所述羟胺的添加量为碳酸钠水溶液的总质量的1％。在以上技术方案的基础上，优选的，步骤四中，所述PBS用量为步骤三中对应出峰段收集产物体积的10倍。在以上技术方案的基础上，优选的，步骤四中，每透析2.5h更换一次透析液，共换液3次。在以上技术方案的基础上，优选的，步骤五中，所述防腐剂为proclin300。本专利技术提供一种采用上述制备方法制备得到的基于葡聚糖的HRP-羊抗鼠IgG标记抗体。本专利技术的基于葡聚糖的HRP-羊抗鼠IgG标记抗体的制备方法以及基于该方法制备得到的基于葡聚糖的HRP-羊抗鼠IgG标记抗体相对于现有技术具有以下有益效果：(1)本专利技术利用葡聚糖作为骨架，将抗体分子和酶偶联在葡聚糖骨架上，通过葡聚糖上的羟基与环氧乙烷结合，从而改性得到大量的环氧基和醛基，利用这些活性基团与发光物质结合，从而实现放大洗好的效果，放大的强度与偶联的分子数量成正比，葡聚糖产品分子量大小涵盖较广，可以选择不同分子量来设计不同大小的多聚物质，也可以控制权及数量来控制同一分子量下，偶联不同数量的检测分子，易于控制信号的强度；(2)本专利技术提供了一种基于葡聚糖的HRP-羊抗鼠IgG标记抗体的制备方法，制备步骤简单，所得产物应用效果良好，相对现有的酶标二抗而言，检测灵敏度更高，具有更好的应用前景。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为采用本专利技术的基于葡聚糖的HRP-羊抗鼠IgG标记抗体以及商品化abcam高灵敏度的正常标记HRP-羊抗鼠IgG显色对比图；图2为采用本专利技术的基于葡聚糖的HRP-羊抗鼠IgG标记抗体的IHC染色图；图3为采用商品化abcam高灵敏度的正常标记HRP-羊抗鼠IgG的IHC染色图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施方式，对本专利技术实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本专利技术一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本专利技术中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本专利技术保护的范围。实施例1制备环氧修饰葡聚糖，选择分子量为3500-20000D的葡聚糖，配置质量浓度为1％的葡聚糖水溶液，用100mM的碳酸钠溶液调整葡聚糖溶液的pH值为11，称取调节pH后的葡聚糖溶液的质量，加入相对葡聚糖溶液质量的1％的环氧氯丙烷，在3℃条件下反应6h，反应完毕，用20mM的盐酸调节反应体系的pH值为2，调节完毕，将产物溶液用分子街流量为1000D的透析袋进行透析，采用10倍体积的pH3.0的10mM柠檬酸作为透析液，每4h更换一次透析液，更换3次后，得到环氧修饰葡聚糖溶液，对环氧修饰葡聚糖溶液进行冷冻干燥，得到环氧修饰葡萄糖。将羊抗鼠IgG与HRP酶按照质量比为1:10进行混合，配置成蛋白浓度为0.5mg/ml的50mM碳酸钠水溶液。向碳酸钠水溶液中加入其溶液质量的0.1％的环氧修饰葡聚糖，用碳酸钠和盐酸调节溶液pH值为10，在37℃下反应0.5h，然后添加碳酸钠水溶液质量的1％的羟胺，在37℃本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于葡聚糖的HRP-羊抗鼠IgG标记抗体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：/n步骤一、将羊抗鼠IgG与HRP酶混合配置成总蛋白浓度为0.5-1.5mg/ml的50-150mM碳酸钠水溶液；/n步骤二、向步骤一所得碳酸钠水溶液中添加环氧修饰葡聚糖，并调节pH值为10-11，在37-45℃下反应1±0.5h，然后添加羟胺，保持37-45℃反应10-50min，用于封闭未反应的环氧基，得到含有偶联羊抗鼠IgG和HRP酶的环氧修饰葡聚糖的混合溶液；/n步骤三、采用葡聚糖G50作为分子筛填料，对步骤二所得含有偶联羊抗鼠IgG和HRP酶的环氧修饰葡聚糖的混合溶液进行柱层析纯化，使用核酸蛋白检测仪对层析柱底部流出的产物进行检测，同时配合自动部分收集器按照出峰顺序收集产物；/n步骤四、将步骤三所收集的不同产物分别装入截留分子量为2000-4000D的透析袋中，使用PBS作为透析液，在3-5℃下透析8-12h，得到透析产物；/n步骤五、使用分光光度计测试透析产物的蛋白浓度，加水稀释控制浓度为0.1-0.5mg/ml，并添加1-2％的牛血清蛋白，50％的甘油和0.1-1％的防腐剂，在-15--25℃下保存，得到基于葡聚糖的HRP-羊抗鼠IgG标记抗体。/n...

【技术特征摘要】
1.一种基于葡聚糖的HRP-羊抗鼠IgG标记抗体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤一、将羊抗鼠IgG与HRP酶混合配置成总蛋白浓度为0.5-1.5mg/ml的50-150mM碳酸钠水溶液；
步骤二、向步骤一所得碳酸钠水溶液中添加环氧修饰葡聚糖，并调节pH值为10-11，在37-45℃下反应1±0.5h，然后添加羟胺，保持37-45℃反应10-50min，用于封闭未反应的环氧基，得到含有偶联羊抗鼠IgG和HRP酶的环氧修饰葡聚糖的混合溶液；
步骤三、采用葡聚糖G50作为分子筛填料，对步骤二所得含有偶联羊抗鼠IgG和HRP酶的环氧修饰葡聚糖的混合溶液进行柱层析纯化，使用核酸蛋白检测仪对层析柱底部流出的产物进行检测，同时配合自动部分收集器按照出峰顺序收集产物；
步骤四、将步骤三所收集的不同产物分别装入截留分子量为2000-4000D的透析袋中，使用PBS作为透析液，在3-5℃下透析8-12h，得到透析产物；
步骤五、使用分光光度计测试透析产物的蛋白浓度，加水稀释控制浓度为0.1-0.5mg/ml，并添加1-2％的牛血清蛋白，50％的甘油和0.1-1％的防腐剂，在-15--25℃下保存，得到基于葡聚糖的HRP-羊抗鼠IgG标记抗体。


2.如权利要求1所述的基于葡聚糖的HRP-羊抗鼠IgG标记抗体的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述羊抗鼠IgG与HRP酶的质量比为1：(10-100)。


3.如权利要求1所述的基于葡聚糖的HRP-羊抗鼠IgG标记抗体的制备方法，其特征在于，步骤二中，所述环氧修饰葡聚糖的制备方法包括：选择分子量为3500-20000D的葡聚糖，配置质量浓度为1-10％的葡聚糖水溶液，采用100mM的碳酸钠溶液调整葡...

【专利技术属性】
技术研发人员：董垚，戴琦，
申请(专利权)人：武汉菲恩生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42