一种信号放大的酶标二抗的制备方法技术

本发明专利技术一种信号放大的酶标二抗的制备方法，属于酶‑高分子结合物技术领域；以生物化学分析中广泛应用的酶标抗体辣根过氧化物酶(HRP)‑IgG为体系，以葡聚糖(Dex)作为载体，制备Dex‑HRP‑IgG结合物，其目标是提高HRP/IgG摩尔比，由此提高酶标抗体的检测灵敏度；通过最优的方式进行葡聚糖、辣根过氧化物酶、羊抗鼠/兔IgG的结合，提高二抗酶标效率，扩大二抗信号扩大作用，提高检测灵敏度。

【技术实现步骤摘要】
一种信号放大的酶标二抗的制备方法
本专利技术属于酶-高分子结合物
，尤其涉及一种信号放大的酶标二抗的制备方法。
技术介绍
免疫酶标基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标技术是最常用的技术。该方法与免疫荧光技术相比的主要优点是：定位准确，对比度好，染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种标记方法，且随着方法的不断改进和创新，其特异性和灵敏度都在不断提高，使用也越来越方便。科研中被广泛应用的为直接酶标记法，该方法是将HRP分子直接标记于二抗上。因此需要普通的酶标二抗即可完成。实验简单，成本低，但是因为没有信号放大作用，灵敏度不高，也易出现背景。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种信号放大的酶标二抗的制备方法，以解决普通的酶标二抗标记是HRP酶分子直接和二抗进行结合，免疫信号不高，灵敏度低的技术问题。为实现上述目的，本专利技术的一种信号放大的酶标二抗的制备方法的具体技术方案如下：首先，以生物化学分析中广泛应用的酶标抗体辣根过氧化物酶(HRP)-IgG为体系，以葡聚糖(Dex)作为载体，制备Dex-HRP-IgG结合物，其目标是提高HRP/IgG摩尔比，由此提高酶标抗体的检测灵敏度；其次，通过最优的方式进行葡聚糖、辣根过氧化物酶、羊抗鼠/兔IgG的结合，提高二抗酶标效率，扩大二抗信号扩大作用，提高检测灵敏度。本专利技术采用高分子化合物进行氧化反应或者氧化氨化反应，而后结合辣根过氧化物酶以及二抗，提高酶标效率，提高酶标二抗信号放大作用，提高检测灵敏度。具体制备过程如下：其中最优的方案为：高分子化合物进行氧化反应或者氧化氨化反应，而后结合辣根过氧化物酶以及二抗。一种信号放大的酶标二抗的制备方法，包括以下步骤，且以下步骤顺次进行：步骤A1、葡聚糖氧化，在室温下将葡聚糖充分溶解于PBS中，加入NaIO4，避光震荡；加入乙二醇进行反应，取反应液用碳酸盐缓冲液透析过夜；步骤A2、oDex-HRP合成，将HRP加碳酸盐缓冲液，立即加入所述步骤A1氧化葡聚糖混合，避光震荡；步骤A3、oDex-HRP-IgG合成，上述聚合物中加入羊抗兔/鼠IgG混合，充分混匀后避光搅拌，往溶液中加入氰基硼氢化钠，室温反应；在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵；离心，弃上清。进一步，所述步骤A4、加入半饱和硫酸铵清洗，最后沉淀物溶于PBS中；将上述溶液装入透析袋中，用PBS透析过夜，加入抗体稀释液混匀，进行分装冰冻保存。进一步，在所述步骤A1和A2之间增加了HRP氧化，包括以下步骤，且以下步骤顺次进行：步骤A1、葡聚糖氧化，在室温下将葡聚糖充分溶解于PBS中，加入NaIO4，避光震荡；加入乙二醇进行反应，取反应液用碳酸盐缓冲液透析过夜；步骤A2'、HRP氧化，将HRP溶解在PH4.4醋酸缓冲液中，加入高碘酸钠溶液，室温下避光搅拌，加入乙二醇，浑匀静置；然后用醋酸缓冲液，4℃透析过夜；步骤A2、oDex-IgG合成，将一部分氧化葡聚糖加入羊抗鼠/兔IgG，室温震荡反应，往溶液中加入氰基硼氢化钠，室温反应；取反应液用碳酸盐缓冲液透析过夜；加入乙二胺盐酸盐，震荡反应，加入氰基硼氢化钠，震荡反应，取反应液用碳酸盐缓冲液透析过夜；步骤A3、oDex-IgG-oHRP合成，取上述反应液，加入氧化HRP和碳酸盐缓冲液，充分混匀后避光搅拌；往溶液中加入氰基硼氢化钠，室温反应；在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，静置离心，弃上清；加入半饱和硫酸铵清洗，最后沉淀物溶于PBS中；将上述溶液装入透析袋中，用PBS透析过夜，加入抗体稀释液混匀，进行分装冰冻保存。进一步，在所述步骤A1和A2'之间增加了葡聚糖氨化，包括以下步骤，且以下步骤顺次进行：步骤A1、葡聚糖氧化，在室温下将葡聚糖充分溶解于PBS中，加入NaIO4，避光震荡；加入乙二醇进行反应，取反应液用碳酸盐缓冲液透析过夜；步骤A2”、葡聚糖氨化，所述步骤A1透析好的葡聚糖加入乙二胺盐酸盐，震荡反应后，加入氰基硼氢化钠，再次震荡反应；而后用碳酸盐缓冲液透析过夜；步骤A2'、HRP氧化，将HRP溶解在醋酸缓冲液中，加入高碘酸钠溶液，室温下避光搅拌一段时间，加入乙二醇，浑匀静置；然后用醋酸缓冲液，透析过夜。步骤A2、aDex-oHRP合成，将所述步骤A2'得到的氧化HRP加碳酸盐缓冲液，然后立即加入氨化葡聚糖混合，室温避光震荡一段时间；再加入氰基硼氢化钠还原，震荡反应；碳酸盐缓冲液透析过夜。步骤A3、aDex-oHRP-IgG合成，取所述步骤A2”得到的氨化葡聚糖和步骤A2得到的HRP的结合物的一半，加入羊抗兔/鼠IgG混合，充分混匀后避光搅拌，往溶液中加入氰基硼氢化钠，室温反应；在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，离心，弃上清；加入半饱和硫酸铵清洗，最后沉淀物溶于PBS中。进一步，所述步骤A5、aDex-oHRP-IgG合成，取上述二分之一的结合物，加入戊二醛，室温静止过夜，逐步滴加羊抗鼠/兔IgG，室温反应；将上述溶液装入透析袋中，用PBS透析过夜，加入抗体稀释液混匀，进行分装冰冻保存。本专利技术的一种信号放大的酶标二抗的制备方法具有以下优点：以生物化学分析中广泛应用的酶标抗体辣根过氧化物酶(HRP)-IgG为体系，以葡聚糖(Dex)作为载体，制备Dex-HRP-IgG结合物，其目标是提高HRP/IgG摩尔比，由此提高酶标抗体的检测灵敏度；通过最优的方式进行葡聚糖、辣根过氧化物酶、羊抗鼠/兔IgG的结合，提高二抗酶标效率，扩大二抗信号扩大作用，提高检测灵敏度；Polymer酶标二抗法，该方法采用一段聚合物做为载体链，将该多聚物与二抗结合，然后可再标记上多个HRP酶分子，实现高灵敏，低背景，操作简便，无需进行内源性生物素标记；通过以多聚物为载体标记多个HRP酶分子，该多聚物同步标记二抗，与一抗进行进行免疫反应测试，达到反应信号放大的目的。具体实施方式为了更好地了解本专利技术的目的、结构及功能，下面结合实施例，对本专利技术一种信号放大的酶标二抗的制备方法做进一步详细的描述。以生物化学分析中广泛应用的酶标抗体辣根过氧化物酶(HRP)-IgG为体系，以葡聚糖(Dex)作为载体，制备Dex-HRP-IgG结合物，其目标是提高HRP/IgG摩尔比，由此提高酶标抗体的检测灵敏度；通过最优的方式进行葡聚糖、辣根过氧化物酶、羊抗鼠/兔IgG的结合，提高二抗酶标效率，扩大二抗信号扩大作用，提高检测灵敏度。本专利技术采用高分子化合物进行氧化反应或者氧化氨化反应，而后结合辣根过氧化物酶以及二抗，提高酶标效率，提高酶标二抗信号放大作用，提高检测灵敏度。具体制备过程如下：将高分子化合物与辣根过氧化物酶及二抗的结合，其中最优的方案为：高分子化合物进行氧化反应或者氧化氨化反应，而后结本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种信号放大的酶标二抗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，且以下步骤顺次进行：/n步骤A1、葡聚糖氧化，在室温下将葡聚糖充分溶解于PBS中，加入NaIO

【技术特征摘要】
1.一种信号放大的酶标二抗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，且以下步骤顺次进行：
步骤A1、葡聚糖氧化，在室温下将葡聚糖充分溶解于PBS中，加入NaIO4，避光震荡；加入乙二醇进行反应，取反应液用碳酸盐缓冲液透析过夜；
步骤A2、oDex-HRP合成，将HRP加碳酸盐缓冲液，立即加入所述步骤A1氧化葡聚糖混合，避光震荡；
步骤A3、oDex-HRP-IgG合成，上述聚合物中加入羊抗兔/鼠IgG混合，充分混匀后避光搅拌，往溶液中加入氰基硼氢化钠，室温反应；在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵；离心，弃上清。


2.根据权利要求1所述的信号放大的酶标二抗的制备方法，其特征在于，所述步骤A4、加入半饱和硫酸铵清洗，最后沉淀物溶于PBS中；将上述溶液装入透析袋中，用PBS透析过夜，加入抗体稀释液混匀，进行分装冰冻保存。


3.根据权利要求1所述的信号放大的酶标二抗的制备方法，其特征在于，在所述步骤A1和A2之间增加了HRP氧化，包括以下步骤，且以下步骤顺次进行：
步骤A1、葡聚糖氧化，在室温下将葡聚糖充分溶解于PBS中，加入NaIO4，避光震荡；加入乙二醇进行反应，取反应液用碳酸盐缓冲液透析过夜；
步骤A2'、HRP氧化，将HRP溶解在PH4.4醋酸缓冲液中，加入高碘酸钠溶液，室温下避光搅拌，加入乙二醇，浑匀静置；然后用醋酸缓冲液，4℃透析过夜；
步骤A2、oDex-IgG合成，将一部分氧化葡聚糖加入羊抗鼠/兔IgG，室温震荡反应，往溶液中加入氰基硼氢化钠，室温反应；取反应液用碳酸盐缓冲液透析过夜；加入乙二胺盐酸盐，震荡反应，加入氰基硼氢化钠，震荡反应，取反应液用碳酸盐缓冲液透析过夜；
步骤A3、oDex-IgG-oHRP合成，取上述反应液，加入氧化HRP和碳酸盐缓冲液，充分混匀后避光搅拌；往溶液中加入氰...

【专利技术属性】
技术研发人员：雍学安，
申请(专利权)人：珠海市丽拓生物科技有限公司，湖南省丽拓生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44