The invention discloses a method for quantitative determination of brain red protein by double anti sandwich method and the application thereof, belonging to the technical field of protein analysis. The detection method with coated Ngb monoclonal antibody to ELISA detection plate as the solid phase antibody, using biotin labeled Ngb polyclonal antibody as enzyme labeled antibody, the HRP coupled with the Avidin polyclonal antibody and biotin binding by TMB staining, 450nm single wavelength determination of absorption value quantitative detection can be achieved, Ngb protein. The method adopts double antibody sandwich ABC, with high specificity and high sensitivity simultaneously. The method can be used to accurately detect the content of Ngb protein in retinal tissue, so as to evaluate the degree of retinal light damage caused by LED light source illumination.
【技术实现步骤摘要】
一种利用双抗夹心法定量测定脑红蛋白的方法及其应用
本专利技术涉及一种利用双抗夹心法定量测定脑红蛋白的方法及其应用,具体涉及一种基于ELISA检测手段定量检测视网膜脑红蛋白表达水平变化及其用于评估LED光源致视网膜光损伤程度的应用,属于蛋白分析
技术介绍
发光二极管(LED)是一种将电能直接转化为可见光的固态半导体。与钨灯不同,LED灯利用蓝光激发荧光粉来产生白光,因此它们含有有害成分极高的可见光谱。由于短波谱(400-500nm)尤其危险,LED照明灯比其他任何光源更有可能导致视网膜光化学损伤。然而,很少有关于视网膜LED光损伤的生物标记物的研究。目前研究比较成熟的光损伤生物标志物是视紫红质,这是由于氧化应激时视网膜光化学损伤的一个重要机制,蓝光照射显著增加在视网膜细胞内线粒体超氧化物自由基的产生,视紫红质的漂白通过氧化应激引起损伤。此外,科学家基于蓝光通过视紫红质诱导视网膜变性的研究,发现当敲除视紫红质基因时,视网膜上没有损害发生。因而视紫红质作为光损伤生物标志物具有一定的优势,然而由于视紫红质很不稳定,而且浓度可能过低使其难以成为理想的光损伤标记物,其检测限以及检测准确度病不能令人满意。目前而言,寻找一个可靠的光损伤标记物已经成为该治疗领域中一个重要的研究方向,也是行业亟需。脑红蛋白Neuroglobin(简称Ngb,译为脑红蛋白),为新近发现的脑组织、神经元特异表达的含血卟啉结构的血红蛋白家族成员。与已知的血红蛋白(hemoglobin)、肌红蛋白(myoglobin)的最大不同是脑红蛋白所含的血红素为六配位键,而非五配位键结构。脑红蛋白( ...
【技术保护点】
一种利用双抗夹心法定量测定脑红蛋白的方法,所述检测方法包括:以包被于ELISA检测板上的Ngb单克隆抗体作为固相抗体,以生物素标记的Ngb多克隆抗体作为酶标抗体,通过显色剂‑Avidin与多克隆抗体上的生物素结合使显色剂通过与其偶联的Avidin与多克隆抗体上的生物素结合,经显色,以定量检测实现Ngb蛋白。
【技术特征摘要】
1.一种利用双抗夹心法定量测定脑红蛋白的方法,所述检测方法包括:以包被于ELISA检测板上的Ngb单克隆抗体作为固相抗体,以生物素标记的Ngb多克隆抗体作为酶标抗体,通过显色剂-Avidin与多克隆抗体上的生物素结合使显色剂通过与其偶联的Avidin与多克隆抗体上的生物素结合,经显色,以定量检测实现Ngb蛋白。2.如权利要求1所述的利用双抗夹心法定量测定脑红蛋白的方法,所述的检测方法包括如下步骤:1)包被:将Ngb单克隆抗体用pH9.6的碳酸钠缓冲液稀释,37℃孵育4h后使用PBST洗涤4次;2)封闭:使用含5%BSA的PBS封闭液封闭,37℃孵育4h后使用PBST洗涤2次;3)捕获抗原:抗原稀释至合适浓度,同时使用PBS作为阴性对照,37℃孵育1h后使用PBST洗涤4次;4)加入二抗:将生物素化的Ngb多克隆抗体稀释后加入到反应孔中,37℃孵育1h后洗涤;5)酶标二抗:将购买的商业化HRP-Avidin稀释1.5万倍后加入到反应孔中,37℃孵育50min后洗涤;6)显色:向反应孔中加入TMB,室温或37℃反应5-30min,显色完毕后加入H2SO4终止反应,于20min内在450nm单波长处测定吸收值。3.如权利要求2所述的利用双抗夹心法定量测定脑红蛋白的方法,其具体包括如下步骤:1)包被:将Ngb单克隆抗体用pH9.6的碳酸钠缓冲液稀释至10μg/ml,每孔加入100μl,37℃孵育4h后按照如下方法洗涤,弃去孔中液体,用PBST洗4次,每次2分钟,甩去孔内液体后在吸水纸上拍干;2)封闭:每孔加200μl含5%BSA的PBS封闭液封闭,37℃孵育4h按照如下方法进行洗涤,PBST洗2次,每次...
【专利技术属性】
技术研发人员:邹伟权,
申请(专利权)人:广州华弘生物科技有限公司,
类型:发明
国别省市:广东,44
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