一种利用双抗夹心法定量测定脑红蛋白的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种利用双抗夹心法定量测定脑红蛋白的方法及其应用，属于蛋白分析技术领域。所述检测方法以包被后Ngb单克隆抗体于ELISA检测板上作为固相抗体，以生物素标记的Ngb多克隆抗体作为酶标抗体，使HRP通过与其偶联的Avidin与多克隆抗体上的生物素结合，经TMB显色，在450nm单波长处测定吸收值，可以实现Ngb蛋白的定量检测。该方法采用双抗体夹心ABC法，同时具有高特异性和高灵敏度。使用该方法可以准确检测视网膜组织中Ngb蛋白含量，从而评估LED光源照明对视网膜光损伤程度。

Method for quantitative determination of brain red protein by double anti sandwich method and application thereof

The invention discloses a method for quantitative determination of brain red protein by double anti sandwich method and the application thereof, belonging to the technical field of protein analysis. The detection method with coated Ngb monoclonal antibody to ELISA detection plate as the solid phase antibody, using biotin labeled Ngb polyclonal antibody as enzyme labeled antibody, the HRP coupled with the Avidin polyclonal antibody and biotin binding by TMB staining, 450nm single wavelength determination of absorption value quantitative detection can be achieved, Ngb protein. The method adopts double antibody sandwich ABC, with high specificity and high sensitivity simultaneously. The method can be used to accurately detect the content of Ngb protein in retinal tissue, so as to evaluate the degree of retinal light damage caused by LED light source illumination.

【技术实现步骤摘要】
一种利用双抗夹心法定量测定脑红蛋白的方法及其应用
本专利技术涉及一种利用双抗夹心法定量测定脑红蛋白的方法及其应用，具体涉及一种基于ELISA检测手段定量检测视网膜脑红蛋白表达水平变化及其用于评估LED光源致视网膜光损伤程度的应用，属于蛋白分析

技术介绍
发光二极管(LED)是一种将电能直接转化为可见光的固态半导体。与钨灯不同，LED灯利用蓝光激发荧光粉来产生白光，因此它们含有有害成分极高的可见光谱。由于短波谱(400-500nm)尤其危险，LED照明灯比其他任何光源更有可能导致视网膜光化学损伤。然而，很少有关于视网膜LED光损伤的生物标记物的研究。目前研究比较成熟的光损伤生物标志物是视紫红质，这是由于氧化应激时视网膜光化学损伤的一个重要机制，蓝光照射显著增加在视网膜细胞内线粒体超氧化物自由基的产生，视紫红质的漂白通过氧化应激引起损伤。此外，科学家基于蓝光通过视紫红质诱导视网膜变性的研究，发现当敲除视紫红质基因时，视网膜上没有损害发生。因而视紫红质作为光损伤生物标志物具有一定的优势，然而由于视紫红质很不稳定，而且浓度可能过低使其难以成为理想的光损伤标记物，其检测限以及检测准确度病不能令人满意。目前而言，寻找一个可靠的光损伤标记物已经成为该治疗领域中一个重要的研究方向，也是行业亟需。脑红蛋白Neuroglobin(简称Ngb，译为脑红蛋白)，为新近发现的脑组织、神经元特异表达的含血卟啉结构的血红蛋白家族成员。与已知的血红蛋白(hemoglobin)、肌红蛋白(myoglobin)的最大不同是脑红蛋白所含的血红素为六配位键，而非五配位键结构。脑红蛋白(Ngb)是一个在神经元内特异性表达的蛋白，它显示为一个对氧有高亲和力的典型球蛋白。Ngb的结构特点、配体结合属性和神经元特异性表达表明它在神经组织的氧气内稳态中发挥重要作用。有研究表明Ngb在视网膜上的浓度比大脑高出100倍，相当于肌肉中肌红蛋白的含量。在视网膜神经核层与神经节层的核周体中检测到Ngb的mRNA，而蛋白质主要在网状层(PLs)和光感受器出现。这独特的分布可能与线粒体的亚细胞定位和相对氧的要求相关，因为视网膜的视觉性能需要大量的氧气来维持由突触传递的光传导。即使具体的机制仍不清楚，但集聚的Ngb提示着其在视觉生理周期起着至关重要的作用。另有研究显示，Ngb在视网膜上有着抗凋亡的保护功能。一个研究在青光眼模型检测Ngb，结果表明，Ngb增加了视网膜细胞的抗氧化能力和Ngb的过度表达可以降低眼内压力相关的过氧化物产生。在急性缺血视网膜损伤模型中Ngb也迅速增加。Ngb似乎是疾病早期阶段的指标。另一个调查显示，Ngb的过度表达与减少线粒体DNA的损伤、保存的视网膜厚度、减少半胱天冬酶3蛋白的激活和Ngb-Tg老鼠的细胞凋亡有关。Lechauve等人表明，通过对老鼠的眼睛进行电穿孔来敲除体内Ngb表达会对视网膜结构和功能造成有害影响，包括神经纤维密度的减少和视觉功能的损害。因此，基于Ngb蛋白的LED光源致视网膜光损伤ELISA检测一方面为生活中LED的广泛应用的带来的潜在视网膜光损伤提供一个新的参考指标和检测工具；另一方面为全面揭示Ngb蛋白的病理意义以及与视网膜疾病的关系的研究提供了一个新手段。蛋白检测方法相对于核酸检测法，避免了蛋白表达的时空调控导致的误差，具有更直接准确的优势。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用双抗夹心法定量测定脑红蛋白的方法，并用于评价LED光源致视网膜光损伤的方法。本专利技术提供一种利用双抗夹心法定量测定脑红蛋白的方法，所述检测方法包括：以包被于ELISA检测板上的Ngb单克隆抗体作为固相抗体，以生物素标记的Ngb多克隆抗体作为酶标抗体，通过显色剂-Avidin与多克隆抗体上的生物素结合使显色剂通过与其偶联的Avidin与多克隆抗体上的生物素结合，经显色，以定量检测实现Ngb蛋白，所述的检测方法的检测原理如附图1所示。在一个具体的实施方案中，所述利用双抗夹心法定量测定脑红蛋白的方法具体包括如下步骤：1)包被：将Ngb单克隆抗体用pH9.6的碳酸钠缓冲液稀释，37℃孵育4h后使用PBST洗涤4次；2)封闭：使用含5％BSA的PBS封闭液封闭，37℃孵育4h后使用PBST洗涤2次；3)捕获抗原：抗原稀释至合适浓度，同时使用PBS作为阴性对照，37℃孵育1h后使用PBST洗涤4次；4)加入二抗：将生物素化的Ngb多克隆抗体稀释后加入到反应孔中，37℃孵育1h后洗涤。5)酶标二抗：将购买的商业化HRP-Avidin稀释1.5万倍后加入到反应孔中，37℃孵育50min后洗涤。6)显色：向反应孔中加入TMB，室温或37℃反应5-30min，显色完毕后加入H2SO4终止反应，于20min内在450nm单波长处测定吸收值。作为上述检测方法所优选的一种实施方式，所述的利用双抗夹心法定量测定脑红蛋白的方法具体包括如下步骤：1)包被：将Ngb单克隆抗体用pH9.6的碳酸钠缓冲液稀释至10μg/ml，每孔加入100μl，37℃孵育4h后按照如下方法洗涤，弃去孔中液体，用PBST洗4次，每次2分钟，甩去孔内液体后在吸水纸上拍干；2)封闭：每孔加200μl含5％BSA的PBS封闭液封闭，37℃孵育4h按照如下方法进行洗涤，PBST洗2次，每次2分钟，甩去孔内液体后在吸水纸上拍干；3)捕获抗原：抗原稀释至合适浓度，每孔100μl加入到对应孔中，阴性对照加100μlPBS，37℃孵育1h，按照步骤1)所述方法洗涤；4)加入二抗：将生物素化的Ngb多克隆抗体稀释至2μg/ml，每孔各加100μl，37℃孵育1h，按照步骤2)所述方法洗涤；5)酶标二抗：将购买的商业化HRP-Avidin稀释1.5万倍，每孔各加100μl，37℃孵育50min，按照步骤1)所述方法洗涤；6)显色检测：每孔加100μlTMB，室温或37℃反应5-30min，显色完毕后，每孔立即加入100μl2MH2SO4终止反应，于20min内检测在450nm单波长处测定吸收值。一种定量测定样品中Ngb蛋白含量的方法，其具体包括如下步骤：1)绘制Ngb蛋白-吸光度标准曲线：将Ngb标准蛋白进行梯度稀释后作为抗原，根据上述方法测定Ngb标准蛋白不同浓度下反应液在450nm下的吸光度，绘制Ngb蛋白-吸光度标准曲线；2)样品中Ngb蛋白含量的测定：将样品稀释至合适浓度后作为抗原，根据上述方法测定样品反应液在450nm下的吸光度，将吸光度代入Ngb蛋白-吸光度标准曲线推算Ngb蛋白浓度，并进而计算样品中Ngb蛋白含量的测定。在一个具体的实施方案中，所述的Ngb的多克隆抗体是利用纯化的Ngb蛋白免疫新西兰大白兔获得。本专利技术还提供一种上述方法的应用，即所述的检测方法在评估视网膜光损伤中的应用，其中所述的视网膜光损伤为LED光源导致。在我们通过深入的研究发现LED光刺激上调了大鼠视网膜脑红蛋白的表达。我们发现在这个以前被认为是安全的蓝色的光照水平，没有造成视网膜细胞凋亡，脑红蛋白的表达量比对照组近2倍。第二，在2小时蓝光照射后，脑红蛋白表达上调更为明显且同时观察到了视网膜损伤。此外，蓝光照射1小时后表达增加两倍，但照射2小时时表达到约七倍。这样的差别暗示着蓝光本身强度的大小会导致脑红蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用双抗夹心法定量测定脑红蛋白的方法，所述检测方法包括：以包被于ELISA检测板上的Ngb单克隆抗体作为固相抗体，以生物素标记的Ngb多克隆抗体作为酶标抗体，通过显色剂‑Avidin与多克隆抗体上的生物素结合使显色剂通过与其偶联的Avidin与多克隆抗体上的生物素结合，经显色，以定量检测实现Ngb蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种利用双抗夹心法定量测定脑红蛋白的方法，所述检测方法包括：以包被于ELISA检测板上的Ngb单克隆抗体作为固相抗体，以生物素标记的Ngb多克隆抗体作为酶标抗体，通过显色剂-Avidin与多克隆抗体上的生物素结合使显色剂通过与其偶联的Avidin与多克隆抗体上的生物素结合，经显色，以定量检测实现Ngb蛋白。2.如权利要求1所述的利用双抗夹心法定量测定脑红蛋白的方法，所述的检测方法包括如下步骤：1)包被：将Ngb单克隆抗体用pH9.6的碳酸钠缓冲液稀释，37℃孵育4h后使用PBST洗涤4次；2)封闭：使用含5％BSA的PBS封闭液封闭，37℃孵育4h后使用PBST洗涤2次；3)捕获抗原：抗原稀释至合适浓度，同时使用PBS作为阴性对照，37℃孵育1h后使用PBST洗涤4次；4)加入二抗：将生物素化的Ngb多克隆抗体稀释后加入到反应孔中，37℃孵育1h后洗涤；5)酶标二抗：将购买的商业化HRP-Avidin稀释1.5万倍后加入到反应孔中，37℃孵育50min后洗涤；6)显色：向反应孔中加入TMB，室温或37℃反应5-30min，显色完毕后加入H2SO4终止反应，于20min内在450nm单波长处测定吸收值。3.如权利要求2所述的利用双抗夹心法定量测定脑红蛋白的方法，其具体包括如下步骤：1)包被：将Ngb单克隆抗体用pH9.6的碳酸钠缓冲液稀释至10μg/ml，每孔加入100μl，37℃孵育4h后按照如下方法洗涤，弃去孔中液体，用PBST洗4次，每次2分钟，甩去孔内液体后在吸水纸上拍干；2)封闭：每孔加200μl含5％BSA的PBS封闭液封闭，37℃孵育4h按照如下方法进行洗涤，PBST洗2次，每次...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹伟权，
申请(专利权)人：广州华弘生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44