一种快速检测uPA及PAI‑1的试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种快速检测uPA及PAI‑1的试剂盒，该试剂盒包括检测反应载体、uPA标准品、PAI‑1标准品，所述的检测反应载体为铺有膜材料的试纸条，所述的试纸条由PVC底板、及位于PVC底板表面的从点样端开始依次为样品垫、荧光标记物结合垫、硝酸纤维膜、吸水纸组成。采用本发明专利技术提供的试剂盒可同时定量测定样本中的uPA和PAI‑1，通过一次加样操作就能对两者的含量进行测定，大大简化了操作过程，具有较高的检测灵敏度，对uPA检测的最低限度为0.01ng/ml，对PAI‑1检测的最低限度为0.1ng/ml，且对两者的检测没有交叉反应，互不干扰，特异性高，可快速评估肿瘤患者的预后症状。

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测uPA及PAI-1的试剂盒
本专利技术属于医学生物类免疫检测试剂领域，具体涉及一种快速检测uPA及PAI-1的试剂盒。
技术介绍
恶性肿瘤严重地威胁着广大人民群众的生命安全及身心健康。早期检测被广泛认为是降低癌症死亡率的最好方法。目前临床应用多种殊检查以期望提高肿瘤的早期诊断率，包括x线检查、超声检查、CT检查、磁共振检查、内腔镜检查等。这些检查手段能够从不同角度、不同侧面对肿瘤进行诊断，各有其局限性。肿瘤标志物的出现使人们对肿瘤的早期诊断寄予了极大希望。肿瘤标志物的检测对肿瘤辅助诊断及判断肿瘤预后、转归、评价疗效，都具有重要的意义。尿激酶纤溶酶原激活剂系统是由尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)及其特异性受体(uPAR)和抑制剂(PAIs，主要为PAI-1)组成。尿激酶纤溶酶原激活剂系统不仅激活纤溶酶，在细胞外基质和基底膜降解中起重要作用，并促进血管形成。在细胞迁移和侵袭过程中，uPA及PAI-1能激活多种蛋白溶解酶，降解细胞外基质、基底膜，促进肿瘤浸润、转移。研究表明，uPA、PAI-1表达与乳腺癌、胃癌等多种肿瘤侵袭、转移有关，国内外相关研究表明，uPA和PAI-1在乳腺癌组织中的表达水平均高于癌旁组织或乳腺良性肿瘤或正常乳腺组织。在美国临床肿瘤学会乳腺癌肿瘤标志物应用指南更新版(2007年)中，uPA和PAI-1已列入乳腺癌患者的预后指标。uPA是一种丝氨酸蛋白酶，由多种肿瘤细胞或其他细胞分泌，其与细胞膜上特异性受体uPAR结合，激活纤溶酶原成为纤溶酶，主要对细胞外基质(ECM)蛋白与基膜水解起作用。另外，uPA还激活潜在活性的胶原酶，与纤溶酶一起均促使细胞外基质(包括层黏连蛋白、纤维连接蛋白、蛋白多糖和Ⅳ型胶原等)和血管基膜的降解，最终导致肿瘤细胞的浸润和转移。除组织中的浓度外，uPA的酶活性受PAIs的调控。PAIs属丝氨酸蛋白酶抑制因子家族，已知有PAI-1、PAI-2和PAI-3三种。PAI-1是一种相对分子质量为52×103的糖蛋白，是正常人血浆中uPA的主要抑制剂。PAI-1能够促进uPA-uPAR的细胞内吞、降解，避免ECM的过度降解，还可以干扰uPAR与细胞表面黏附因子、ECM成分的结合，使细胞黏附力降低，促进肿瘤细胞迁移。目前有关PAI-1在肿瘤生物学中的确切作用还不清楚，其在纤溶酶原激活系统中可能担当重要的调节剂或者是肿瘤细胞防止自身降解的保护剂，而不是这个系统单纯的抑制剂。也有学者认为，PAI-1在肿瘤浸润转移中与uPA有协同和调节作用。多项研究发现，uPA、PAI-1在多种肿瘤组织中表达，如乳癌、胃癌、子宫内膜癌等，两者的高表达可促进肿瘤的浸润和转移，uPA和PAI-1的表达增加提示癌症患者具有高的复发率，是恶性肿瘤的不良预后因素。现有技术多采用免疫组化方法或ELISA法检测肿瘤组织或患者血清中uPA、PAI-1的表达，采用免疫组化方法只能对uPA、PAI-1进行定性或半定量测定，因此，不能得到uPA、PAI-1定量检测结果以实现对病情的诊断或治疗情况进行监测。采用ELISA试剂盒虽然可以对uPA或PAI-1进行定量测定，但重复性较差，精密度较低，操作过程繁琐，受人为操作因素影响很大，不利于高通量的全自动检测，特异性和灵敏性有待提高。因此，有必要开发一种操作简单，兼具高的检测灵敏性和特异性，且能同时检测uPA、PAI-1的试剂盒，以满足市场的需求。免疫层析技术是基于抗原抗体特异性免疫反应的一种新型膜检测技术。层析过程中，以结合了标记物的待测液为流动相，通过毛细管作用，在固相膜上与受体发生特异性反应从而富集，根据肉眼可见的标记物(如胶体金、胶体硒等)或酶反应的显色条带来定性检测或定量检测。目前没有关于利用免疫层析技术同时检测uPA、PAI-1的相关研究报道。
技术实现思路
为解决现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于一种操作简单，兼具高的检测灵敏性和特异性，且能同时检测uPA、PAI-1的试剂盒，以满足市场的需求。本专利技术另外一个目的在于提供一种所述检测uPA、PAI-1的试剂盒的使用方法。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案实现的：本专利技术提供了一种快速检测uPA及PAI-1的试剂盒，其包括检测反应载体、uPA标准品、PAI-1标准品，所述的检测反应载体为铺有膜材料的试纸条，所述的试纸条由PVC底板、及位于PVC底板表面的从点样端开始依次为样品垫、荧光标记物结合垫、硝酸纤维膜、吸水纸组成。进一步地，所述的荧光标记物结合垫的膜材料为玻璃纤维纸，所述的玻璃纤维纸上包被荧光乳胶标记稳定液，所述的硝酸纤维膜上离加样端较近的一侧依次有uPA检测线、PAI-1检测线、质控线，所述的uPA检测线上包被有uPA抗体，PAI-1检测线上包被有PAI-1抗体，质控线上包被有羊抗鼠免疫球蛋白IgG。进一步地，所述的荧光乳胶标记稳定液为含2～6％(w/v)3-(N-吗啉)丙磺酸、1～2％(w/v)十二烷基磺酸钠、0.5～1％(w/v)海藻酸钠、1～2％(w/v)甘氨酸的荧光乳胶颗粒标记的uPA抗体和PAI-1抗体混合液。优选地，所述的荧光乳胶标记稳定液为含6％(w/v)3-(N-吗啉)丙磺酸、1.5％(w/v)十二烷基磺酸钠、0.5％(w/v)海藻酸钠、2％(w/v)甘氨酸的荧光乳胶颗粒标记的uPA抗体和PAI-1抗体混合液。其中，上述的荧光乳胶颗粒标记的uPA抗体和PAI-1抗体混合液为荧光乳胶颗粒标记的uPA抗体溶液与荧光乳胶颗粒标记的PAI-1抗体溶液以的1:1的体积比混合。进一步地，所述的荧光乳胶颗粒标记的uPA抗体或PAI-1抗体均为鼠源的单克隆抗体。本专利技术提供的试剂盒主要依赖抗体抗原特异性结合反应，采用双抗夹心免疫层析和荧光乳胶免疫层析技术来捕获并分离目标物质，具体为：1)当样品中同时存在uPA和PAI-1抗原时，每种抗原首先与荧光乳胶颗粒标记的对应的单抗结合，形成抗原-荧光乳胶标记抗体复合物，通过毛细管作用，层析到检测线处，所述的抗原-荧光乳胶标记抗体复合物与层析线上另一种uPA抗体或PAI-1抗体结合，形成抗体-抗原-荧光乳胶标记抗体的双抗夹心复合物，在uPA检测线和PAI-1检测线均产生红色的条带，未与检测线上抗体结合的荧光乳胶标记抗体继续向上层析，到达质控线，质控线上的羊抗鼠免疫球蛋白IgG会与荧光乳胶标记抗体结合，产生红色条带，判定为阳性结果；2)当样品中只存在uPA或PAI-1抗原时，只产生一条红色的条带(uPA检测线或和PAI-1检测线上)，质控线出现红色条带；3)当样品中不存在uPA和PAI-1抗原时，则检测线处不出现红色条带，只在质控线处出现红色条带，判定为阴性结果；4)当检测线处出现红色条带，但质控线上不出现红色条带，判定结果无效，需重新试验。本专利技术还提供一种所述的荧光乳胶颗粒标记的uPA抗体或PAI-1抗体溶液的制备，其包括以下步骤：(1)将荧光乳胶微球体溶液在20000rpm离心10min，去除上清收集沉淀物，然后加入PBS缓冲溶液调节荧光乳胶微球体浓度为1.0╳1012个/mL，在100W超声波中分散30s，得乳胶微球分散液；(2)往乳胶微球分散液中依次加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，震荡混合均匀，置于恒温摇本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速检测uPA及PAI‑1的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括检测反应载体、uPA标准品、PAI‑1标准品，所述的检测反应载体为铺有膜材料的试纸条，所述的试纸条由PVC底板、及位于PVC底板表面的从点样端开始依次为样品垫、荧光标记物结合垫、硝酸纤维膜、吸水纸组成。

【技术特征摘要】
1.一种快速检测uPA及PAI-1的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括检测反应载体、uPA标准品、PAI-1标准品，所述的检测反应载体为铺有膜材料的试纸条，所述的试纸条由PVC底板、及位于PVC底板表面的从点样端开始依次为样品垫、荧光标记物结合垫、硝酸纤维膜、吸水纸组成。2.根据权利要求1所述的检测uPA及PAI-1的试剂盒，其特征在于，所述的荧光标记物结合垫的膜材料为玻璃纤维纸，所述的玻璃纤维纸上包被荧光乳胶标记稳定液，所述的硝酸纤维膜上离加样端较近的一侧依次有uPA检测线、PAI-1检测线、质控线，所述的uPA检测线上包被有uPA抗体，PAI-1检测线上包被有PAI-1抗体，质控线上包被有羊抗鼠免疫球蛋白IgG。3.根据权利要求2所述的检测uPA及PAI-1的试剂盒，其特征在于，所述的荧光乳胶标记稳定液为含2～6％(w/v)3-(N-吗啉)丙磺酸、1～2％(w/v)十二烷基磺酸钠、0.5～1％(w/v)海藻酸钠、1～2％(w/v)甘氨酸的荧光乳胶颗粒标记的uPA抗体和PAI-1抗体混合液。4.根据权利要求3所述的检测uPA及PAI-1的试剂盒，其特征在于，所述的荧光乳胶标记稳定液为含6％(w/v)3-(N-吗啉)丙磺酸、1.5％(w/v)十二烷基磺酸钠、0.5％(w/v)海藻酸钠、2％(w/v)甘氨酸的荧光乳胶颗粒标记的uPA抗体和PAI-1抗体混合液。5.根据权利要求3或4所述的检测uPA及PAI-1的试剂盒，其特征在于，所述的荧光乳胶颗粒标记的uPA抗体和PAI-1抗体混合液为荧光乳胶颗粒标记的uPA抗体溶液与荧光乳胶颗粒标记的PAI-1抗体溶液以的1:1的体积比混合。6.根据权利要求5所述的检测uPA及PAI-1的试剂盒，其特征在于，所述的荧光乳胶颗粒标记的uPA抗体或PAI-1抗体溶液的制备包括以下步骤：(1)将荧光乳胶微球体溶液在20000rpm离心10min，去除上清收集沉淀物，然后加入PBS缓冲溶液调节荧光乳胶微球体浓度为1.0╳1012个/mL，在100W超声波中分散30s，得乳胶微球分散液；(2)往乳胶微球分散液中依次加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，震荡混合均匀，置于恒温摇床进行反应30min，然后在...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈立国，邹伟权，张亚丽，李庆祥，母润红，王涛，苏焱，
申请(专利权)人：广州华弘生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44