一步快速检测甜瓜多种病毒的试剂盒及其快速检测方法，它涉及一种快速检测甜瓜病毒病的试剂盒及其快速检测方法。它解决了现有甜瓜病毒病多重RT-PCR检测技术可同时检测的甜瓜病毒病种类少的问题。一步快速检测甜瓜多种病毒的试剂盒中含有7对RT-PCR引物。快速检测方法：一、提取被感染病毒叶片的总RNA；二、反转录成cDNA；三、用试剂盒中的7对RT-PCR引物进行多重RT-PCR。本发明专利技术通过一次PCR可以同时检测出多达7种的甜瓜病毒病，可在田间采集、鉴定甜瓜病毒病种类，具有鉴定过程简单、步骤少、设备要求低、费用少、时间短和精确性高等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及一种快速检测甜瓜病毒病的试剂盒及其快速检测方法。
技术介绍
甜瓜病毒病一直是限制甜瓜生产的主要因素，目前国内外没有一种有效的方法可 W防治甜瓜病毒病。病毒病在瓜产区复合感病的情况比较普遍。目前检测甜瓜病毒病病毒 种类的方法有双抗体夹屯、法（DAS-ELISA)和硝酸纤维素膜法（NCM-ELISA)法、血清抗原检 测等方法；但运些方法操作复杂、费用高、需要时间较长。 多重RT-PCR技术可同时检测几种致病菌，大大缩短了检验时间和流程，节省了供 试材料，尤其适合一些难分离，难获取的种质材料或病源分离物的快速检测。但是，由于多 重RT-PCR体系中存在多对引物，因此各引物对必须保持高度的特异性（W避免非特异性的 扩增）；而且各对引物所扩增出的目的片段的大小差异性要大，可W通过电泳或其他方法 区分（避免条带重叠或误判）；还要避免所用引物间的相互作用；各引物对须保持相对一致 的扩增效率等要求。并且，不同长度的模板核酸片段、不同引物对所要求的退火溫度也不一 样。加之其他限制因素，多重RT-PCR技术难W在甜瓜病毒病的实际检测中有优异的表现， 可同时检测的甜瓜病毒病种类极少。引物对越多扩增难度就越大，因此，目前所知植物病毒 多重RT-PCR检测技术最多只能一次同时检测5种。
技术实现思路
本专利技术是为了解决现有甜瓜病毒病多重RT-PCR检测技术可同时检测的甜瓜病毒 病种类少的问题，而提供的一种。 阳0化]一步快速检测甜瓜多种病毒的试剂盒中含有7对RT-PCR引物； 用于扩增西瓜花叶病毒病的引物对：上游引物WMV1F的核巧酸 序列为5' -GAGGAACTGTGGTTCATGTC-3'，下游引物WMV1R的核巧酸序列为 5' -GCAGTGTGCCTCTCAGTATT-3'; W07] 用于扩增黄瓜花叶病毒病的引物对：上游引物CMV1F的核巧酸序列为 5' -GACAGTTGGGAATCGGA-3'，下游引物CMV1R的核巧酸序列为 5' -AACAGGGAGCAAGAGGA-3' ； W08] 用于扩增小西葫芦黄花叶病毒病的引物对：上游引物ZYMV-F的核巧 酸序列为5' -CACGAAGGACAAGGATGTGA-3'，下游引物ZYMV-R的核巧酸序列为 5> -ACATTGCTAAGAGCTGCTGC-3> ; 用于扩增南瓜花叶病毒的引物对：上游引物SqMV-1-F的核巧酸 序列为5' -GGATGCCTTTGGCTATTGG-3'，下游引物SqMV-1-R的核巧酸序列为 5> -GCCTCCTCGTGGCTTTGTA-3> ; 用于扩增烟草花叶病毒病的引物对：上游引物TMV-F的核巧酸序列为 5' -TTTTGGAGGAATGAGTTT-3'，下游引物TMV-R的核巧酸序列为 5' -AGGGAAAAACACTATGC-3' ； W11] 用于扩增番木瓜环斑病毒的引物对：上游引物PRSV-F的核巧酸 序列为5' -CTCGTGCCACTCAATCTCAA-3'，下游引物PRSV-R的核巧酸序列为 5' -TTCCACTGTGTGTCTCTCCG-3'; 阳01引用于扩增甜瓜黄斑病毒的引物对：上游引物MYSVF的核巧酸序 列为5' -TTGAGGCAGGATCTGAAGTC-3'，下游引物MYSVR的核巧酸序列为 5' -GGCCAATCTGATCCAGAGTA-3'。 用上述一步快速检测甜瓜多种病毒的试剂盒快速检测的方法： 一、提取被感染病毒叶片的总RNA; 阳〇1引二、反转录成cDNA; Ξ、用试剂盒中的7对RT-PCR引物进行多重RT-PCR，即可确定叶片是否感染了西 瓜花叶病毒病、黄瓜花叶病毒病、小西葫芦黄花叶病毒病、南瓜花叶病毒、烟草花叶病毒病、 番木瓜环斑病毒和甜瓜黄斑病毒，W及病毒类型； 阳017] 步骤Ξ中7对RT-PCR引物为用于扩增西瓜花叶病毒病的引物对：上游引物WMV1 F的核巧酸序列为5' -GAGGAACTGTGGTTCATGTC-3'，下游引物WMV1R的核巧酸序列为 5' -GCAGTGTGCCTCTCAGTATT-3';[001引用于扩增黄瓜花叶病毒病的引物对：上游引物CMV1F的核巧酸序列为 5' -GACAGTTGGGAATCGGA-3'，下游引物CMV1R的核巧酸序列为 5' -AACAGGGAGCAAGAGGA-3' ； 用于扩增小西葫芦黄花叶病毒病的引物对：上游引物ZYMV-F的核巧 酸序列为5' -CACGAAGGACAAGGATGTGA-3'，下游引物ZYMV-R的核巧酸序列为 5> -ACATTGCTAAGAGCTGCTGC-3> ; 用于扩增南瓜花叶病毒的引物对：上游引物SqMV-1-F的核巧酸 序列为5' -GGATGCCTTTGGCTATTGG-3'，下游引物SqMV-1-R的核巧酸序列为 5> -GCCTCCTCGTGGCTTTGTA-3>; W21] 用于扩增烟草花叶病毒病的引物对：上游引物TMV-F的核巧酸序列为 5' -TTTTGGAGGAATGAGTTT-3'，下游引物TMV-R的核巧酸序列为 5' -AGGGAAAAACACTATGC-3' ； 阳02引用于扩增番木瓜环斑病毒的引物对：上游引物PRSV-F的核巧酸 序列为5' -CTCGTGCCACTCAATCTCAA-3'，下游引物PRSV-R的核巧酸序列为 5' -TTCCACTGTGTGTCTCTCCG-3';[002引用于扩增甜瓜黄斑病毒的引物对：上游引物MYSVF的核巧酸序 列为5' -TTGAGGCAGGATCTGAAGTC-3'，下游引物MYSVR的核巧酸序列为 5' -GGCCAATCTGATCCAGAGTA-3' ； 步骤Ξ多重RT-PCR扩增体系为25化，包括2μL的模板cDNA、2μL的引物对、浓 度为1.Ommol/L的dNTPs、酶活为1U的TaqDNA聚合酶和浓度为2.Ommol/L的Mg2+; 阳0巧]步骤Ξ多重RT-PCR反应程序为94°C预变性4min，94°C变性40s、50°C退火复性353、72°(：延伸6〇3,35个循环；72°(：延伸7111111。 西瓜花叶病毒病（WMV)、黄瓜花叶病毒病化州mbermosaicviroicKCMV)、小西葫 芦黄花叶病毒病狂YMV)、南瓜花叶病毒（SqMV)、烟草花叶病毒病灯MV)、番木瓜环斑病毒 (PRSV)和甜瓜黄斑病毒（MYSV)是甜瓜病毒病中常见的种类，而且在我国感染、发病率高。 本专利技术一步快速检测甜瓜多种病毒的试剂盒针对西瓜花叶病毒病（WMV)、黄瓜花 叶病毒病化州mbermosaicviroid(CMV)、小西葫芦黄花叶病毒病狂YMV)、南瓜花叶病毒 (SqMV)、烟草花叶病毒病灯MV)、番木瓜环斑病毒（PRSV)和甜瓜黄斑病毒（MYSV)设计了 7 对特异性引物。扩增西瓜花叶病毒病的引物对所扩增出的核巧酸片段长度为1149bp，扩 增黄瓜花叶病毒病的引物对所扩增出的核巧酸片段长度为98化P，扩增小西葫芦黄花叶病 毒病的引物对所扩增出的核巧酸片段长度为789bp，扩增南瓜花叶病毒的引物对所扩增出 的核巧酸片段长度为604本文档来自技高网...
【技术保护点】
一步快速检测甜瓜多种病毒的试剂盒，其特征在于一步快速检测甜瓜多种病毒的试剂盒中含有7对RT‑PCR引物；用于扩增西瓜花叶病毒病的引物对：上游引物WMV1 F的核苷酸序列为5’‑GAGGAACTGTGGTTCATGTC‑3’，下游引物WMV1 R的核苷酸序列为5’‑GCAGTGTGCCTCTCAGTATT‑3’；用于扩增黄瓜花叶病毒病的引物对：上游引物CMV1 F的核苷酸序列为5’‑GACAGTTGGGAATCGGA‑3’，下游引物CMV1 R的核苷酸序列为5’‑AACAGGGAGCAAGAGGA‑3’；用于扩增小西葫芦黄花叶病毒病的引物对：上游引物ZYMV‑F的核苷酸序列为5’‑CACGAAGGACAAGGATGTGA‑3’，下游引物ZYMV‑R的核苷酸序列为5’‑ACATTGCTAAGAGCTGCTGC‑3’；用于扩增南瓜花叶病毒的引物对：上游引物SqMV‑1‑F的核苷酸序列为5’‑GGATGCCTTTGGCTATTGG‑3’，下游引物SqMV‑1‑R的核苷酸序列为5’‑GCCTCCTCGTGGCTTTGTA‑3’；用于扩增烟草花叶病毒病的引物对：上游引物TMV‑F的核苷酸序列为5’‑TTTTGGAGGAATGAGTTT‑3’，下游引物TMV‑R的核苷酸序列为5’‑AGGGAAAAACACTATGC‑3’；用于扩增番木瓜环斑病毒的引物对：上游引物PRSV‑F的核苷酸序列为5’‑CTCGTGCCACTCAATCTCAA‑3’，下游引物PRSV‑R的核苷酸序列为5’‑TTCCACTGTGTGTCTCTCCG‑3’；用于扩增甜瓜黄斑病毒的引物对：上游引物MYSV F的核苷酸序列为5’‑TTGAGGCAGGATCTGAAGTC‑3’，下游引物MYSV R的核苷酸序列为5’‑GGCCAATCTGATCCAGAGTA‑3’。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：玉山江·麦麦提，杨渡，韩盛，李继洋，丁新华，吐尔逊·阿合买提，何丹，米日古丽·马木提，
申请(专利权)人：新疆农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：新疆;65
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