一种快速检测左旋肉碱的方法及其试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种快速高效检测左旋肉碱含量的方法及试剂盒，该方法包括：准备包含冻干乙酰辅酶A和乙酰肉碱转移酶的微孔板A、包含沉淀剂包被的微孔板B；在微孔板A上设置标准孔、质控孔、样品孔，先将显色溶液加入各个孔，再将标准品、质控、及待测样品分别加入到相应的微孔中反应，进行酶显色检测，并测定其光吸收值(OD)；参照微孔板A在微孔板B同样操作，反应后进行酶显色检测，并测定其光吸收值(OD空白)；基于两次酶显色的光吸收值的差值(OD‑OD空白)，通过构建标准曲线来确定待测样品中左旋肉碱的含量。本发明专利技术减少了检测过程中试剂的配制，操作更简便，酶活力能稳定保持，检测结果更可靠，方法检出限达1mg/100g。

Method and kit for rapidly detecting L-carnitine

The invention discloses a method and reagent of fast and efficient detection of L-carnitine content of the box, the method includes: preparing freeze-dried containing acetyl coenzyme A and acetyl carnitine transferase enzyme, A microplate contains precipitant coated microtiter plate B; sample hole hole, hole, set the standard of quality control in microtiter plate A. The first color solution into each hole, then the standard and quality control, and the sample were added to the corresponding micro reaction, enzyme colorimetric detection and determination of the light absorption value (OD); according to the same operation in the microplate A microplate B reaction after the colorimetric detection. And determination of the light absorption value (OD; blank) two times the difference between the colorimetric absorbance value based on (OD, OD blank) by constructing a standard curve to determine the content of the sample to be measured l-carnitine. The invention reduces the reagent preparation in the detection process, the operation is simpler, the enzyme activity can be stably maintained, and the detection result is more reliable, and the detection limit is up to 1mg/100g.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及食品检测领域，尤其涉及一种快速检测左旋肉碱的方法及其试剂盒。
技术介绍
左旋肉碱又称L-肉碱，是一种促使脂肪转化为能量的内氨基酸，红色肉类是左旋肉碱的主要来源，对人体无毒副作用，左旋肉碱也是条件性婴儿必需的营养物质，在婴儿利用脂肪作为能量来源的代谢中起重要作用。左旋肉碱在婴幼儿食品、饮料、饼干以及一些减肥产品中普遍存在。目前文献报道中测定左旋肉碱的方法有高效液相色谱法、毛细管电泳法和质谱分析法等，但分光光度法仍是最主要的检测方法。分光光度法检测左旋肉碱大多需要先发生一步化学反应，例如样品中游离的左旋肉碱在乙酰肉碱转移酶的催化作用下与乙酰辅酶A反应，生成游离的辅酶A，辅酶A被进一步氧化后产生有色物质或具有紫外吸收的物质，颜色深浅与左旋肉碱的含量成正比，进而间接检测游离的左旋肉碱的含量。国标GB29989中对婴幼儿食品和乳品中左旋肉碱的检测原理和方法做了明确规定，主要采用比色法，测试样经过水提取，用高氯酸沉淀蛋白质后过滤，滤液经碱皂化后，结合态的左旋肉碱游离出来，左旋肉碱与乙酰辅酶A在乙酰肉碱转移酶的催化下反应生成乙酰肉碱和游离的辅酶A。游离的辅酶A和2-硝基苯甲酸反应生成黄色物质，其颜色深浅与游离的辅酶A含量成正比。因游离的辅酶A与左旋肉碱是等摩尔反应关系，可间接求出试样中左旋肉碱含量。目前国标法检测左旋肉碱含量，采用紫外分光光度计，主要有以下几个方面的缺点：(1)乙酰辅酶A和肉碱乙酰转移酶费用昂贵，检测成本很大；(2)所耗费的体积较大，采用传统比色皿进行测试，需要2-3mL体积的用量，在比色阶段比较耗时；(3)所用到的酶以水溶液形式保存，其有效期有限，酶活力会受到很大程度影响，严重影响实验的稳定性；(4)样品处理需要称量5g，后期样品处理消耗试剂量大，在对某些基质处理上不能透明，影响后续的检测效果。专利技术专利申请(CN106198531A)：检测左旋肉碱含量的方法：将待测样品与显色液和乙酰辅酶A进行第一接触和第一酶标检测；将第一接触后样品与肉碱乙酰转移酶进行第二接触和第二酶标检测；以及基于第二酶标检测与第一酶标检测的差值，确定待测样品中左旋肉碱的含量。国标GB29989中，样品处理方法复杂、耗时长，并且试剂用量大，检测过程繁琐，重复性差；而现有的左旋肉碱检测试剂盒试剂配制和保存繁琐，反应体系复杂。专利技术专利申请CN106198531A实际上就是GB29989检测体系的缩小版，改变试剂的用量实现在酶标板上的检测，在技术上没实质创新，仍不能解决酶的保存有效期和实验稳定性问题。BioVision及Sigma等公司已有针对左旋肉碱的检测试剂盒，其原理是将一个乙酰基团从乙酰辅酶A转运到肉碱上，生成的游离辅酶A随后参与到Oxi-Red探针的氧化过程，使其发出荧光，并用酶标仪读取在570nm处的吸收峰，目前市场上存在的试剂盒大多基于该原理。
技术实现思路
为了克服现有方法的不足，可以快速高效地检测试样中的左旋肉碱含量，本专利技术提供快速检测左旋肉碱的方法及试剂盒，不仅能大大缩短试样中左旋肉碱的提取时间，避免了复杂的反应体系，减少在微孔板中的加样步骤，而且使用酶标仪可以快速批量地检测试样中左旋肉碱的含量。首先，本专利技术提供一种快速检测左旋肉碱的方法，包括：一种快速高效检测左旋肉碱含量的方法，其特征在于，包括：(1)、准备包含冻干乙酰辅酶A和乙酰肉碱转移酶的微孔板A、包含沉淀剂包被的微孔板B；(2)、在微孔板A上设置标准孔、质控孔、样品孔，先将显色溶液加入各个孔，再将标准品、质控、及待测样品分别加入到相应的微孔中反应，进行酶显色检测，获得其光吸收值(OD)；(3)、参照步骤(2)在微孔板B同样操作，反应后进行酶显色检测，获得其光吸收值(OD空白)；(4)、基于两次酶显色的光吸收值的差值(OD-OD空白)，通过构建标准曲线来确定待测样品中左旋肉碱的含量。优选地，步骤(1)中微孔板A还包括沉淀剂，微孔板A的制备过程如下：(a)乙酰辅酶A溶液的制备称取20.0mg乙酰辅酶A溶于2.0mL水中，取400μL-600μL与5-50μL甘油和25-100mgD-海藻糖混匀；(b)乙酰肉碱转移酶溶液的制备吸取100μL乙酰肉碱转移酶悬浮液，经1500r/min离心10min，弃去上层清液，沉淀用2mL水溶解，取400μL-800μL与5-50μL甘油和25-100mgD-海藻糖混匀；(c)冻干处理在微孔板的微孔中加入5-10μL乙酰辅酶A溶液和5-10μL乙酰肉碱转移酶溶液，并将该含乙酰辅酶A和乙酰肉碱转移酶的微孔板放入-80℃下预冻30-60min，之后于冻干机中-70～-80℃下冻干6～8h，使乙酰辅酶A和乙酰肉碱转移酶得以固定并干燥于微孔中，将冻干后获得微孔板A，将其置于低温干燥条件下保存备用。优选地，所述步骤(2)中显示液采用5x浓缩显色溶液，其配置方法如下：分别称取50mg2-硝基苯甲酸、5.96gN-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、185mg乙二胺四乙酸二钠溶于30mL去离子水中，用10mol/LNaOH溶液调pH至7.4～7.6，然后用水定容至50mL，5倍稀释使用。优选地，待测样品制备方法如下：准确称取1.0g混合均匀的试样于烧杯中，用5-10mL水在35-45℃溶解，加入2mL13％高氯酸溶液，混合均匀后放置5-10min，使试样中的蛋白质变性沉淀，用蒸馏水定容至20mL，混匀，离心。取滤液0.8mL，加入0.08mL4mol/L氢氧化钾溶液置于35—45℃水浴震荡10-15min，使结合态的左旋肉碱游离出来。冷却后用13％高氯酸调节pH为6.0～8.0，加入15-30μL氯化钙，加水至2mL，混匀后4000-15000rpm离心，取上清液检测。最后上清液一定要保证澄清。按该过程，样品稀释倍数为50倍。优选地，待测样品制备方法如下：称取5.0g试样于三角瓶中，加入20-40mL0.1mol/LHCl，超声提取15-30min，用4％NaOH将pH值调至7.0～7.5，转入50mL容量瓶中定容后混匀，用滤纸过滤或离心后取滤液检测。优选地，待测样品制备方法如下：取试样5.0g，用温水溶解样品并转入50mL容量瓶中后加入5-15mL质量分数为3.6％的亚铁氰化钾、5—15mL质量分数为7.2％的硫酸锌以及15-30mL100mMNaOH溶液，每次加入都要混匀。定容，混合，过滤，取滤液检测。优选地，步骤(2)中，设置7个标准孔，左旋肉碱标准品配制浓度分别为：0、1.6、3.2、6.4、9.6、16、22.4μg/mL。优选地，步骤(2)、(3)中的酶显色检测均采用酶标仪在波长410-420nm测试吸光度，以二者的吸光度差作纵坐标，浓度值为横坐标，作标准曲线，从标准曲线中读出样品浓度，所得浓度乘以稀释倍数为待测样品中最终所含左旋肉碱浓度。本专利技术的有益效果如下：通过96孔板反应，减少反应体积和试剂的使用量，进而节约了成本；通过直接将乙酰辅酶A和乙酰肉碱转移酶冻干固定于微孔板上，与其他检测试剂盒相比，减少了检测过程中试剂的配制并且减少了加样步骤，使操作更为简便，方法检出限达1mg/100g；通过酶标仪读数，可以实现批量检测，使检测过程更加高效，大大降低了时间成本并且具有高重现性；改良了试样的处理方法，使本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速高效检测左旋肉碱含量的方法，其特征在于，包括：(1)、准备包含冻干乙酰辅酶A和乙酰肉碱转移酶的微孔板A、包含沉淀剂包被的微孔板B；(2)、在微孔板A上设置标准孔、质控孔、样品孔，先将显色溶液加入各个孔，再将标准品、质控、及待测样品分别加入到相应的微孔中反应，进行酶显色检测，获得其光吸收值(OD)；(3)、参照步骤(2)在微孔板B同样操作，反应后进行酶显色检测，获得其光吸收值(OD空白)；(4)、基于两次酶显色的光吸收值的差值(OD‑OD空白)，通过构建标准曲线来确定待测样品中左旋肉碱的含量。

【技术特征摘要】
1.一种快速高效检测左旋肉碱含量的方法，其特征在于，包括：(1)、准备包含冻干乙酰辅酶A和乙酰肉碱转移酶的微孔板A、包含沉淀剂包被的微孔板B；(2)、在微孔板A上设置标准孔、质控孔、样品孔，先将显色溶液加入各个孔，再将标准品、质控、及待测样品分别加入到相应的微孔中反应，进行酶显色检测，获得其光吸收值(OD)；(3)、参照步骤(2)在微孔板B同样操作，反应后进行酶显色检测，获得其光吸收值(OD空白)；(4)、基于两次酶显色的光吸收值的差值(OD-OD空白)，通过构建标准曲线来确定待测样品中左旋肉碱的含量。2.根据权利要求1所述的左旋肉碱含量的方法，其特征在于，步骤(1)中微孔板A还包括沉淀剂，微孔板A的制备过程如下：(a)乙酰辅酶A溶液的制备称取20.0mg乙酰辅酶A溶于2.0mL水中，取400μL-600μL与5-50μL甘油和25-100mgD-海藻糖混匀；(b)乙酰肉碱转移酶溶液的制备吸取100μL乙酰肉碱转移酶悬浮液，经1500r/min离心10min，弃去上层清液，沉淀用2mL水溶解，取400μL-800μL与5-50μL甘油和25-100mgD-海藻糖混匀；(c)冻干处理在微孔板的微孔中加入5-10μL乙酰辅酶A溶液和5-10μL乙酰肉碱转移酶溶液，并将该含乙酰辅酶A和乙酰肉碱转移酶的微孔板放入-80℃下预冻30-60min，之后于冻干机中-70～-80℃下冻干6～8h，使乙酰辅酶A和乙酰肉碱转移酶得以固定并干燥于微孔中，将冻干后获得微孔板A，将其置于低温干燥条件下保存备用。3.根据权利要求2所述的左旋肉碱含量的方法，其特征在于，所述步骤(2)中显示液采用5x浓缩显色溶液，其配置方法如下：分别称取50mg2-硝基苯甲酸、5.96gN-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、185mg乙二胺四乙酸二钠溶于30mL去离子水中，用10mol/LNaOH溶液调pH至7.4～7.6，然后用水定容至50mL，5倍稀释使用。4.根据权利要求3所述的左旋肉碱含量的方法，其特征在于，待测样品制备方...

【专利技术属性】
技术研发人员：张路，齐延林，胡云平，
申请(专利权)人：深圳市瑞赛生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44