天门冬氨酸氨基转移酶检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及天门冬氨酸氨基转移酶(AST)检测试剂盒，属于临床体外诊断试剂技术领域。本发明专利技术的目的是能够提供有效消除内源性α‑酮戊二酸干扰且稳定性良好的天门冬氨酸氨基转移酶检测试剂盒，使测定天门冬氨酸氨基转移酶的结果更加准确可靠。本发明专利技术的试剂盒包括试剂1和试剂2：其中试剂1的组分包括：Tris‑HCl缓冲液、L‑天门冬氨酸、还原型辅酶(NADH)、苹果酸脱氢酶(MDH)、酶保护剂、稳定剂、防腐剂；试剂2的组分包括：Tris‑HCl缓冲液、α‑酮戊二酸、稳定剂、防腐剂。本发明专利技术所提供的AST检测试剂盒加入酶保护剂、稳定剂，提高了天门冬氨酸氨基转移酶检测试剂盒的稳定性，适用于各类全自动生化分析仪，操作简单、安全，便于临床应用推广。

Aspartate aminotransferase ELISA Kit

The invention relates to a aspartate aminotransferase (AST) detection kit, which belongs to the technical field of clinical in vitro diagnostic reagents. The purpose of the invention is to provide effective elimination of endogenous alpha ketoglutarate interference and good stability of the aspartate aminotransferase test kit, the determination of aspartate aminotransferase results more accurate and reliable. The kit of the invention comprises a reagent 1 and reagent 2: reagent 1 components: Tris HCl buffer and L aspartic acid, reduced coenzyme (NADH), malate dehydrogenase (MDH) enzyme, protective agent, stabilizer, preservative agent; 2 components: Tris HCl buffer, alpha ketoglutaric acid, stabilizers, preservatives. Box AST kit provided by the invention adding enzyme protective agent, stabilizer, improve the aspartate aminotransferase enzyme stability test kit, applicable to all kinds of automatic biochemical analyzer, simple operation, safety, convenient for clinical application.

【技术实现步骤摘要】

：本专利技术属于临床体外诊断试剂
，涉及天门冬氨酸氨基转移酶检测试剂盒。
技术介绍
：天门冬氨酸氨基转移酶(AST)也称为谷草转氨酶，主要存在于心肌细胞中，肝细胞次之。在心肌细胞内含量较多，当心肌梗死时，血清中AST活力增高，在发病后6-12h之内显著增高，在48h达到高峰，约在3-5天恢复正常。血清中AST也可来源于肝细胞，各种肝病可引起血清中AST的升高，中毒性肝炎还可更高。肌炎症、胸膜炎、肾炎等也可引起血清AST的轻度增高，还可能存在心肌细胞、肝细胞及骨骼肌损伤。临床上主要用于病毒性肝炎、阻塞性黄疸、心肌梗死的辅助诊断。目前体外检测天门冬氨酸氨基转移酶(AST)的方法主要有赖氏法、酶偶联比色法及连续监测法(速率法)。赖氏法的缺点是标本AST活性高时，草酰乙酸对AST显示的反馈抑制，使测定结果偏低；酶偶联比色法所用的氯化硝基四氮唑蓝(NBT)有毒，可能有致癌性，不满足绿色原则；连续监测法的优点是可以确定线性期并计算每分钟吸光度的变化(ΔA/min)，根据此值再准确地计算酶活性，可以利用全自动生化分析仪进行检测；酶和底物反应的特异性好，检测结果准确度高。以上三种方法相比较，采用连续监测法较佳。本专利技术的试剂盒主要采用连续监测法进行检测，该方法是国际临床化学和实验室医学联盟(IFCC)推荐方法。其检测原理为：AST催化L-天门冬氨酸的氨基转移至α-酮戊二酸，生成草酰乙酸和L-谷氨酸。苹果酸脱氢酶(MDH)催化草酰乙酸还原的同时将还原型辅酶(NADH)氧化成氧化型辅酶(NAD+)，由于NADH在340nm处有特征吸收，所以NADH的下降速率和AST的活力成正比。反应式如下：本专利技术涉及的天门冬氨酸氨基转移酶检测试剂盒，无需样本前处理，可直接利用全自动生化分析仪进行大批量样本检测，操作简单、准确度高、稳定性好，适合临床应用推广。
技术实现思路
：本专利技术的目的在于提供天门冬氨酸氨基转移酶检测试剂盒供临床应用，主要解决现有AST检测领域存在的准确度低、操作繁琐、污染环境、试剂不稳定等问题。为了解决本专利技术内源性α-酮戊二酸对天门冬氨酸(AST)测定的干扰，采用如下技术方案：采用两步法检测，血清与(缺少α-酮戊二酸)的底物溶液混合，37℃保温5min，使样品中所含内源性α-酮戊二酸引起的副反应进行完毕。然后加入α-酮戊二酸启动AST的催化反应，在主波长340nm处连续监测吸光度下降速率，根据线性反应期吸光度下降速率(-ΔA/min)，计算出AST活力。本专利技术提供的试剂盒由试剂1和试剂2组成，其中试剂1的组成和成份如下：Tris-HCl缓冲液120mmol/L-180mmol/L，PH＝8.2L-天门冬氨酸400mmol/L-600mmol/L还原型辅酶(NADH)0.2mmol/L-0.4mmol/L苹果酸脱氢酶(MDH)800U/L-1200U/L酶保护剂稳定剂防腐剂试剂2的组成和成份如下：Tris-HCl缓冲液60mmol/L-100mmol/L，PH＝7.4α-酮戊二酸60mmol/L-80mmol/L稳定剂防腐剂所述酶保护剂选自牛血清白蛋白(BSA)或甘油与糖类中的一种或多种组合物，其用量为BSA0.1％-2％，甘油5％-20％，优选为BSA0.5％-1.5％，甘油10％-15％。以上所述糖类可选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖中的一种或多种，其用量为1g/L-15g/L，优选为5g/L-10g/L。所述试剂1和试剂2的稳定剂均选自KCl及表面活性剂组合物，其用量为KCl1g/L-15g/L，优选为5g/L-10g/L。以上所述表面活性剂可选自吐温-20(Tween-20)、吐温-80(Tween-80)、曲拉通X-100(TritonX-100)、聚乙二醇6000(PEG6000)及聚乙二醇8000(PEG8000)中的一种或多种，其用量为0.1％-2％，优选为0.5％-1.5％。所述试剂1和试剂2的防腐剂均可选自NaN3或Proclin-300，其用量为NaN30.1g/L-2g/L，Proclin-3000.1％-2％，优选为NaN30.6g/L-1g/L，Proclin-3000.5％-1％。本专利技术天门冬氨酸氨基转移酶(AST)检测试剂盒适用于各类全自动生化分析仪，现于全自动生化分析仪BS-420上的应用，其具体使用方法如下：表1样本检测操作程序计算方法：样品中的AST含量(U/L)＝ΔAT/min×FΔAT/min：测定管平均每分钟相对空白管吸光度变化注：TV：试剂样品总体积，SV为样品体积；6.22：NADH在340nm处的毫摩尔分子吸光系数；1.0：比色皿光径(cm)；1000：U/mL到U/L的转换系数。本专利技术所使用的质控品为罗氏高、低值质控品；所测样品为不溶血血清。有益效果：本专利技术天门冬氨酸氨基转移酶检测试剂盒为液体双试剂，采用两步法，有效消除内源性α-酮戊二酸干扰，提高了AST测定的准确度；本专利技术试剂盒中加入酶保护剂和稳定剂，提高了AST试剂盒的稳定性，于37℃水浴可稳定至少一周，说明2-8℃保存可以至少稳定一年。以下结合具体实施例进一步说明本专利技术，应理解，具体实施方式仅用于说明本专利技术，而非限制本专利技术。附图说明：图1是本专利技术实施例1-3及对比实施例2-8℃保存一周的空白吸光度变化对比试验结果图；图2是本专利技术实施例1-3及对比实施例37℃水浴一周的空白吸光度变化对比试验结果图。具体实施方式实施例1天门冬氨酸氨基转移酶检测试剂盒，由试剂1和试剂2组成，具体成分及含量如下：试剂1的组成：Tris-HCl缓冲液120mmol/L，PH＝8.2L-天门冬氨酸400mmol/LNADH0.2mmol/L苹果酸脱氢酶800U/LKCl5g/L吐温-200.5％BSA1％蔗糖5g/LProclin-3000.5％试剂2的组成：Tris-HCl缓冲液100mmol/L，PH＝7.4α-酮戊二酸60mmol/LKCl6g/LPEG60000.5％Proclin-3000.5％实施例2天门冬氨酸氨基转移酶检测试剂盒，由试剂1和试剂2组成，具体成分及含量如下：试剂1的组成：Tris-HCl缓冲液150mmol/L，PH＝8.2L-天门冬氨酸500mmol/LNADH0.3mmol/L苹果酸脱氢酶1000U/LKCl8g/L曲拉通X-1001％甘油10％麦芽糖6g/LProclin-3001％试剂2的组成：Tris-HCl缓冲液80mmol/L，PH＝7.4α-酮戊二酸70mmol/LKCl8g/LPEG80001％Proclin-3001％实施例3天门冬氨酸氨基转移酶检测试剂盒，由试剂1和试剂2组成，具体成分及含量如下：试剂1的组成：Tris-HCl缓冲液180mmol/L，PH＝8.2L-天门冬氨酸600mmol/LNADH0.4mmol/L苹果酸脱氢酶1200U/LKCl10g/L曲拉通X-1001.5％PEG80001.5％甘油15％果糖6g/L葡糖糖6g/LNaN31g/L试剂2的组成：Tris-HCl缓冲液60mmol/L，PH＝7.4α-酮戊二酸80mmol/LKCl10g\本文档来自技高网...

【技术保护点】
天门冬氨酸氨基转移酶检测试剂盒，由试剂1和试剂2组成，其特征在于，试剂1的组成和成份如下：Tris‑HCl缓冲液120mmol/L‑180mmol/L，PH＝8.2L‑天门冬氨酸400mmol/L‑600mmol/L还原型辅酶(NADH)0.2mmol/L‑0.4mmol/L苹果酸脱氢酶(MDH)800U/L‑1200U/L酶保护剂稳定剂防腐剂试剂2的组成和成份如下：Tris‑HCl缓冲液60mmol/L‑100mmol/L，PH＝7.4α‑酮戊二酸60mmol/L‑80mmol/L稳定剂防腐剂。

【技术特征摘要】
1.天门冬氨酸氨基转移酶检测试剂盒，由试剂1和试剂2组成，其特征在于，试剂1的组成和成份如下：Tris-HCl缓冲液120mmol/L-180mmol/L，PH＝8.2L-天门冬氨酸400mmol/L-600mmol/L还原型辅酶(NADH)0.2mmol/L-0.4mmol/L苹果酸脱氢酶(MDH)800U/L-1200U/L酶保护剂稳定剂防腐剂试剂2的组成和成份如下：Tris-HCl缓冲液60mmol/L-100mmol/L，PH＝7.4α-酮戊二酸60mmol/L-80mmol/L稳定剂防腐剂。2.如权利要求1所述的天门冬氨酸氨基转移酶检测试剂盒，其特征在于，所述酶保护剂选自牛血清白蛋白(BSA)或甘油与糖类中的一种或多种组合物，其用量为BSA0.5％-1.5％，甘油10％-15％。3.如权利要求2所述的糖类，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王贤俊，张敏，
申请(专利权)人：王贤俊，
类型：发明
国别省市：浙江;33