一种用于微生物定量检测维生素的培养方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种用于微生物定量检测维生素的培养方法及试剂盒，培养方法通过以下步骤进行：（1）将微生物接种到固体培养基中，真空活化培养，菌落重悬于二价阳离子‑双糖溶液中，菌悬液注入凝胶混合液，获得微菌球；（2）将微菌球与复合营养增殖剂固定化于载体中；（3）使用缓冲剂溶解配制测试培养基。本培养方法确保不影响检测背景及非特异性增长的前提下，优化菌种活化方法及干燥菌种的制备，提高微生物稳定性利于休眠菌种快速恢复生长活性，打破限制生长因素增加菌体在有限培养体系中的生长密度，补充营养增殖成分提高菌种活力，缩短冻干微生物法应用于维生素检测的培养周期，同时提高微生物法对维生素的灵敏性。

【技术实现步骤摘要】
一种用于微生物定量检测维生素的培养方法及试剂盒
本专利技术属于维生素检测
，具体涉及一种用于微生物定量检测维生素的高活性高密度快速培养方法及试剂盒。
技术介绍
微生物法作为一种活试剂，具有自身的特异性和高度的灵敏性。国标中规定，微生物法是作为测定食品中维生素B12、叶酸、生物素、泛酸、维生素B6、烟酸和烟酰胺等维生素的首选方法。微生物法检测维生素是通过绘制维生素含量与缺陷型测试菌生长浊度的标准曲线，间接测定样品中维生素的含量，国标微生物法检测维生素培养时间一般为16~24h，但国标法中将菌种接种至琼脂培养基，活化菌落较小，测试菌种需传2~3代增强活力。而已预先包埋冻干菌种的维生素检测试剂盒，省去了测试菌种的制备过程，但由于冻干菌的水分含量低，菌种处于休眠状态，且冻干过程造成菌种的生理性损伤，同时培养体系的整体缩小，均会使其再水化后的培养具有较长的延滞期，使得培养时间延长至44~48h。在现有技术中，一般通过添加天然物质来促进微生物增殖，如番茄汁、土豆汁、香菇汁、牛肉浸膏、酵母粉等，天然物质对微生物的生长繁殖有较好的效果，但有效成分不完全明了且富含维生素，容易导致微生物在维生素检测应用中增加检测本底的干扰，不同批次制备的天然提取物还存在差异。微生物生长过程会产生有机酸（如乳酸、丁酸和醋酸等）、过氧化氢和细菌素等有抑活性的代谢物质，这些抑菌物质在培养环境中的积累会限制微生物的继续生长。而在发酵工业中，常通过在非封闭培养过程中不断补充新鲜营养液，优化生长环境来提高菌体的增殖速率，要保持各种设备无渗漏、无污染是极其困难的。美国专利US8357504B2），中国专利（CN201611094901、CN201710001500、CN201710001918、CN201710001927及CN201910188685）等公开的维生素检测试剂盒，试剂盒检测的基本原理与国际标准完全相同，但上述专利技术方案仍存在如下问题：1）冻干保护剂的制备中，氯化钙与维生素测试培养基直接混合易形成沉淀，造成有效冻干保护成分的损失；2）菌种冻干状态为粘性颗粒物，不利于菌种的长期稳定贮存，开封后易吸潮；3)冻干菌种存在较长的延滞期，使得微生物测定维生素的培养时间由16~24h延长至44~48h；4）脱脂奶粉含大量维生素，作为菌种保护剂，易造成较高的检测本底。因此，开发一种适用于定量检测维生素的微生物增殖方法至关重要。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供了一种用于微生物定量检测维生素的高活性高密度快速的培养方法及其试剂盒，本培养方法确保不影响检测背景及非特异性增长的前提下，优化菌种活化方法及干燥菌种的制备，提高微生物稳定性利于休眠菌种快速恢复生长活性，打破限制生长因素增加菌体在有限培养体系中的生长密度，补充营养增殖成分提高菌种活力，缩短冻干微生物法应用于维生素检测的培养周期，同时提高微生物法对维生素的灵敏性。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案予以实现的。一种用于微生物定量检测维生素的培养方法，其通过以下步骤进行：（1）将微生物接种到固体培养基中，再将已接种的培养皿进行真空活化培养，挑取培养皿上的菌落重悬于二价阳离子-双糖溶液中，当菌悬液注入凝胶混合液，菌悬液表面形成一层凝胶膜包埋于凝胶包裹层，获得微菌球；（2）将步骤（1）的微菌球与复合营养增殖剂固定化于载体中；（3）根据维生素测试粉末培养基的配制比，使用缓冲剂溶解配制培养基。上述微菌球制备过程用到的二价阳离子-双糖溶液和凝胶混合液可帮助菌种吸附并固定于容器中，并对菌种保护作用。所述复合营养增殖剂具有缩短菌种延滞期以达到菌种快速恢复活性的效果，利于检测效率的提高。所述缓冲剂可消除菌种生长过程中酸性代谢物质的积累，抑制菌种的生长保证微生物生长过程对营养物质高效的吸收利用，加快微生物增殖速度的同时提高空间内的生长密度。本专利技术人意外发现，通过上述三者的协同作用，该培养方法在不影响定量检测本底的前提下，增大微生物对待测维生素的灵敏性，提高微生物在有限培养体系中的增殖速度及生长密度（至少提高20%的菌种生长密度），从而实现检测培养周期的缩短（将培养时间44~48h缩短至16~24h），该培养方法适用于莱氏蔓士乳酸杆菌及其变异菌株、植物乳酸杆菌及其变异菌株、鼠李糖乳酸杆菌及其变异菌株、发酵乳酸杆菌及其变异菌株、卡尔斯伯酵母菌及其变异菌株、酿酒酵母及其变异菌株等微生物检测不同维生素中的应用。作为本专利技术提供的所述的用于微生物定量检测维生素的培养方法的一种实施方式，所述真空活化培养是指将已接种的培养皿置入透明袋中，抽真空后密封活化培养。作为本专利技术提供的所述的用于微生物定量检测维生素的培养方法的一种实施方式，在步骤（1）所述真空活化培养中，活化温度为35~42℃，活化时间为16~24h，菌悬液透光率为60~80%。作为本专利技术提供的所述的用于微生物定量检测维生素的培养方法的一种实施方式，在步骤（1）中，所述二价阳离子-双糖溶液通过0.05~0.2M氯化钙/氯化镁/氯化锰溶液与0.1M~0.5M海藻糖/蔗糖/乳糖溶液按体积比1:1混合，过滤除菌获得。作为本专利技术提供的所述的用于微生物定量检测维生素的培养方法的一种实施方式，在步骤（1）中，所述微菌球通过取5~50μL凝胶混合液滴入载体中，再取2.5~25μL菌悬液注入凝胶混合液中获得。优选但不限定地，所述载体类型包括：微孔板（200~450μL）、离心管（300~5000μL）、培养试管（1mL~10mL）。作为本专利技术提供的所述的用于微生物定量检测维生素的培养方法的一种实施方式，在步骤（1）中，所述凝胶混合液通过0.5~2倍维生素测试培养基与0.05~0.2wt%黄原胶/卡拉胶/瓜尔胶/聚丙烯酸钠/海藻酸钠溶液按体积比1:1混合，过滤除菌获得。作为本专利技术提供的所述的用于微生物定量检测维生素的培养方法的一种实施方式，在步骤（2）中，所述复合营养增殖剂包括黄嘌呤、抗坏血酸、天门冬酰胺、盐酸吡哆醛、盐酸吡哆胺、L-半胱氨酸盐酸盐、血清白蛋白、卵清蛋白或卵粘蛋白中的一种或多种组合。优选地，1L复合营养增殖剂组分为1~5g黄嘌呤、5~50g抗坏血酸、5~50g天门冬酰胺、0.2~0.5g盐酸吡哆醛、0.2~0.5g盐酸吡哆胺、5~50gL-半胱氨酸盐酸盐、10~50g血清白蛋白、1~5g卵清蛋白、2~20g卵粘蛋白中的一种或多种组合，通过121℃高压灭菌15min或0.22~0.45μm滤膜过滤除菌。作为本专利技术提供的所述的用于微生物定量检测维生素的培养方法的一种实施方式，在步骤（2）中，所述固定化微菌球与复合营养增殖剂是指取1~10μL复合营养增殖剂滴在载体中所述微菌球的对角处，采用真空冷冻干燥技术将微菌球与复合营养增殖剂进行固定化干燥24~48h。作为本专利技术提供的所述的用于微生物定量检测维生素的培养方法的一种实施方式，在步骤（3）中，所述缓冲剂包括磷酸氢二钾（钠）、磷酸二氢钾（钠）、吗啉乙磺酸、碳酸氢钠、柠檬酸或柠檬酸钠中的一种或至少本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于微生物定量检测维生素的培养方法，其特征在于，通过以下步骤进行：/n（1）将微生物接种到固体培养基中，再将已接种的培养皿进行真空活化培养，挑取培养皿上的菌落重悬于二价阳离子-双糖溶液中，当菌悬液注入凝胶混合液，菌悬液表面形成一层凝胶膜包埋于凝胶包裹层，获得微菌球；/n（2）将步骤（1）的微菌球与复合营养增殖剂固定化于载体中；/n（3）根据维生素测试粉末培养基的配制比，使用缓冲剂溶解配制培养基。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于微生物定量检测维生素的培养方法，其特征在于，通过以下步骤进行：
（1）将微生物接种到固体培养基中，再将已接种的培养皿进行真空活化培养，挑取培养皿上的菌落重悬于二价阳离子-双糖溶液中，当菌悬液注入凝胶混合液，菌悬液表面形成一层凝胶膜包埋于凝胶包裹层，获得微菌球；
（2）将步骤（1）的微菌球与复合营养增殖剂固定化于载体中；
（3）根据维生素测试粉末培养基的配制比，使用缓冲剂溶解配制培养基。


2.根据权利要求1所述的用于微生物定量检测维生素的培养方法，其特征在于，所述真空活化培养是指将已接种的培养皿置入透明袋中，抽真空后密封活化培养。


3.根据权利要求1或2所述的用于微生物定量检测维生素的培养方法，其特征在于，在步骤（1）所述真空活化培养中，活化温度为35~42℃，活化时间为16~24h，菌悬液透光率为60~80%。


4.根据权利要求1所述的用于微生物定量检测维生素的培养方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述二价阳离子-双糖溶液通过0.05~0.2M氯化钙/氯化镁/氯化锰溶液与0.1M~0.5M海藻糖/蔗糖/乳糖溶液按体积比1:1混合，过滤除菌获得。


5.根据权利要求1或4所述的用于微生物定量检测维生素的培养方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述凝胶混合液通过0.5~2倍维生素测试用培养基与0.05~...

【专利技术属性】
技术研发人员：张恒，王舒乐，齐延林，
申请(专利权)人：深圳市瑞赛生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44