一种重组大肠杆菌的固定化方法及其在丙谷二肽合成中的应用技术

本发明专利技术公开一种过表达转酯酶重组大肠杆菌的固定化方法及其在丙谷二肽生物催化合成中的应用，其包括培养过表达转酯酶的重组大肠杆菌至对数期，再使用固定化材料将所述重组大肠杆菌进行包埋后诱导培养。采用本发明专利技术所述的固定化时序，本发明专利技术公开了固定化细胞的使用方法，实验结果显示，反应可连续进行600h，且保持产量不降低；生产连续进行10批次以上，收集到的反应液中丙谷二肽浓度在70～76mM之间。固定化细胞活性高，且可回收利用，更可实现连续化反应，转化率基本维持不变。本发明专利技术所述方法操作简单，产品转化率高，分离容易，生产效率高且成本低，容易实现规模化生产，具有良好的工业化应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种重组大肠杆菌的固定化方法及其在丙谷二肽合成中的应用
本专利技术涉及重组菌的固定化生产方法
，具体涉及一种过表达转酯酶重组大肠杆菌的固定化方法及其在丙谷二肽生物催化合成中的应用。
技术介绍
丙谷二肽(L-Ala-Gln)，又称为N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，具有溶解度高，水溶性和热稳定性强的优点已逐渐替代谷氨酰胺(L-Gln)成为主要的肠外营养用药。目前，丙谷二肽的合成主要采用化学合成法和化学合成结合生物酶催化法、微生物产酶合成法。化学合成法生产丙谷二肽反应步骤多、副产物多、试剂毒性大且非环境友好(唐果.N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽的合成与反应研究.厦门大学，2004；中国专利，丙－谷二肽合成方法，CN1392156A)。而化学+生物酶催化法也存在用酶量大，肽生产率低等缺点。(于清新，丙谷二肽的酶促合成研究。天津大学，2010)。微生物产酶合成法是通过筛选菌株得到可用于催化丙氨酰-谷氨酰胺合成的转酯酶，将分离纯化后的酶或直接将微生物菌株应用于催化丙氨酸与谷氨酰胺合成Ala-Gln二肽。(KenzoYokozeki.Anovelandefficientenzymaticmethodfortheproductionofpeptidesfromunprotectedstartingmaterials.JournalofBiotechnology115(2005)211-220)此方法的缺点是筛选合适的菌株耗时耗力，酶的表达量不够，造成酶催化时间长的问题，同时酶的纯化过程也很复杂。研究人员还从枯草芽胞杆菌中获得了一种氨基酸连接酶(Lal)，开发出发酵生产二肽的专利技术，但这种催化合成丙谷二肽的过程需要外源提供ATP，导致二肽的生产成本仍然较高，无法在市场大范围推广使用(TabataK，HashimotoS.FermentativeproductionofL-alanyl-L-glutaminebyametabolicallyengineeredEscherichiacolistrainexpressingL-aminoacidα-ligase.Appliedandenvironmentalmicrobiology，2007，73(20):6378-6385.中国专利，2017100517990)。CN104480075A和CN105274174A公开了两种转酯酶催化合成丙谷二肽的方法，其采用酶冻干粉或液体酶缓冲液进行催化反应，但由于酶分离纯化成本高，且反应后难于回收再利用，不适用于实际工业化生产。中国专利技术专利CN106754985B公开一种编码丙谷二肽生物合成酶的基因及其应用，并提供含有该基因的重组大肠杆菌以及利用其进行生物转化合成丙谷二肽的方法。本专利技术所述的基因及其重组工程菌的应用，具有摩尔转化率高，反应速率快，分离容易，且成本低等优势，为丙谷二肽的工业化生产奠定了基础。但还存在细胞需离心收集后才能重复使用、操作步骤多、需要生产操作间歇期等缺点。
技术实现思路
本专利技术设计一种对数生长期细胞进行固定化的方法及针对固定化细胞进行诱导的新工艺，即在细胞生长至对数中后期时进行固定化，所固定化的细胞经诱导后可进行催化合成反应，固定化细胞可回收利用，且反应效果与诱导结束后固定化的细胞相比，合成目的产物的效果更为优良。一方面，本专利技术保护一种过表达转酯酶重组大肠杆菌的固定化方法，其步骤包括：(1)将过表达转酯酶的重组大肠杆菌培养至细胞密度为OD6000.4～1.0；(2)使用固定化材料将步骤(1)获得的重组大肠杆菌进行包埋后诱导培养。在上述技术方案中，优选的，所述的固定化材料选自豆油、琼脂粉，豆油、琼脂糖，CaCl2、海藻酸钠、卡拉胶中的至少一种。在上述技术方案中，优选的，所述的固定化材料的包埋方法为将菌体加入1～2％固定化材料混匀后，滴加到交联剂中进行包埋，所述的交联剂选自豆油、2～3％KCl、2～3％CaCl2。在上述技术方案中，优选的，所述的诱导培养的条件为：使用终浓度为0.2～2.0mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导培养；更为优选的IPTG终浓度为0.3mM。在上述技术方案中，优选的，所述的诱导培养的条件为：低温培养至少12h，更为优选的温度为16～20℃；更为优选的诱导培养时间为16h。在上述技术方案中，优选的，所述的过表达转酯酶重组大肠杆菌为含有丙谷二肽生物合成酶的重组大肠杆菌。所述步骤(1)中细胞选自酵母、大肠杆菌或枯草芽孢杆菌；本专利技术中的含有丙谷二肽生物合成酶的重组大肠杆菌为E.coliBL21-pET29a-AET。实际上，本申请中的重组菌并非仅限于实施例中公开的重组大肠杆菌E.coliBL21-pET29a-AET，其他具有可诱导特征的重组菌或细胞，均适应于本申请上文所述的“先包埋固定，后诱导培养”的技术方案，且也能取得更好的技术效果。在上述技术方案中，优选的，所述步骤(1)中细胞培养所用的培养基为含有碳源和氮源的微生物培养基；优选的培养基为添加抗生素的LB培养基；其中，所述抗生素为卡那霉素，卡那霉素在培养基中的浓度为30～150μg/mL，更为优选的抗生素浓度为50μg/mL。另一方面，本专利技术保护利用上述固定化方法在丙谷二肽生物催化合成中的应用。上文所述的应用中，优选的，所述的在丙谷二肽生物催化合成中所用的底物为L-丙氨酸甲酯盐酸盐(L-Ala-OMe)和L-谷氨酰胺(L-Gln)混合物；混合物中L-丙氨酸甲酯盐酸盐(L-Ala-OMe)和L-谷氨酰胺(L-Gln)的摩尔比例是2：1～1：3。上文所述的应用中，优选的，L-丙氨酸甲酯盐酸盐在缓冲液中的浓度范围是0.1～1.0M，优选0.1～0.6M；L-谷氨酰胺在缓冲液中的浓度范围是0.1～1.0M，优选0.2～0.8M。上文所述的应用中，优选的，所述底物的缓冲液为硼酸盐缓冲液；更为优选的缓冲液浓度为0.1～1.0mM，pH7.5～9.5；最优选的缓冲溶液为浓度是0.2mM的pH9的硼酸盐缓冲液。上文所述的应用中，优选的，所述的收集培养后的包埋细胞进行批式生物合成或连续式生物合成。上文所述的应用中，优选的，所述的批式生物合成方法为：(3-1)将底物加入缓冲液中制备含有底物的反应液，再加入利用上述步骤(1)(2)所述方法获得的固定化的细胞，调节pH为8.0～9.0，体系在20～30℃条件下反应，至pH值不再降低作为反应终点，移去反应液；添加新的反应底物，重复步骤(3-1)，从收集到的反应液中获得终产品。上文所述的应用中，优选的，所述的连续式生物合成方法为：(3-2)将上述步骤(1)(2)所述方法获得的固定化细胞装入中空柱中，将底物加入缓冲液中制备含有底物的反应液，将含有底物的反应液以一定的流速加入到含有固定化细胞的柱中，进行丙谷二肽的连续化生产。上文所述的应用中，优选的，所述的中空柱选自任一高径比为(12～16)：1的有机玻璃柱、PVC柱、金属柱等可填充柱。上文所述的应用中，优选的，所述的流速范围为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种过表达转酯酶重组大肠杆菌的固定化方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)将过表达转酯酶的重组大肠杆菌培养至细胞密度为OD

【技术特征摘要】
1.一种过表达转酯酶重组大肠杆菌的固定化方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将过表达转酯酶的重组大肠杆菌培养至细胞密度为OD6000.4～1.0；
(2)使用固定化材料将步骤(1)获得的重组大肠杆菌进行包埋后诱导培养。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的固定化材料选自琼脂粉，琼脂糖，海藻酸钠、卡拉胶中的至少一种。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的固定化材料的包埋方法为将菌体加入1～2％固定化材料混匀后，滴加到交联剂中进行包埋，所述的交联剂选自豆油、2～3％KCl、2～3％CaCl2。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的过表达转酯酶重组大肠杆菌为重组大肠杆菌BL21-pET29a-AET。


5.如权利要求1所述固定化方法在丙谷二肽生物催化合成中的应用。


6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的在丙谷二肽生物催化合成中所用的底物为L-丙氨酸甲酯盐酸盐和L-谷氨酰胺的混合物，且混合物中L-丙氨酸甲酯盐酸盐和L-谷氨酰胺的摩尔比...

【专利技术属性】
技术研发人员：齐佳琨，范超，裴绪泽，袁文杰，刘军，吴文忠，
申请(专利权)人：大连医诺生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁;21