本发明专利技术公开了一种胃蛋白酶原II(PGII)定量测定试剂盒，该试剂盒包括校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂和发光底物。本发明专利技术还公开了该试剂盒的制备方法与使用该试剂盒检测胃蛋白酶原II(PGII)的方法。本发明专利技术以异硫氰酸荧光素标记的胃蛋白酶原II(PGII)包被抗体和碱性磷酸酶标记的胃蛋白酶原II(PGII)标记抗体制备抗试剂，以抗异硫氰酸荧光素抗体偶联羧基磁珠制得磁微粒试剂，使免疫反应更容易混匀和分离，而且大大提高了反应速度，以新型化学发光底物APLS为底物，提高了试剂盒的灵敏度和特异性性能。本发明专利技术的检测试剂盒性能可靠、灵敏度高、线性范围宽，可配合半自动、全自动仪器使用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医疗器械生物类免疫体外诊断领域，主要涉及一种基于磁微粒分离化 学发光法定量检测血液中胃蛋白酶原II(PGII)的试剂盒及其制备方法，以及应用该试剂 盒定量检测血液中胃蛋白酶原II(PGII)的方法。
技术介绍
胃蛋白酶原是胃蛋白酶的前体，根据其生化性质和免疫原性将其分成2个亚群， 1-5组分的免疫原性相同，称为胃蛋白酶原I，主要由胃底腺的主细胞和黏液颈细胞分泌； 组分6和7被称为胃蛋白酶原II，除由胃底腺的主细胞和黏液颈细胞分泌外，贲门腺和胃窦 的幽门腺的黏液颈细胞以及十二指肠上段也能产生胃蛋白酶原II。 通常情况下，约有1 %的PG透过胃黏膜毛细血管进入血液循环，进入血液循环的 PG在血液中非常稳定；血清PGI和PGII反映胃黏膜腺体和细胞的数量，也间接反映胃黏 膜不同部位的分泌功能；当胃黏膜发生病理变化时，血清PG含量也随之改变；因此，监测血 清中PG的浓度可以作为监测胃黏膜状态的手段。 血清PG水平反映了不同部位胃粘膜的形态和功能：PGI是检测胃泌酸腺细胞功能 的指针，胃酸分泌增多PGI升高，分泌减少或胃粘膜腺体萎缩PGI降低；PGII与胃底粘膜 病变的相关性较大（相对于胃窦粘膜），其升高与胃底腺管萎缩、胃上皮化生或假幽门腺化 生、异型增值有关；PGI/II比值进行性降低与胃粘膜萎缩进展相关。因此，联合测定PGI和 PGII比值可起到胃底腺粘膜"血清学活检"的作用。 在国内，胃蛋白酶原II(PGII)检测临床上主要以国外进口试剂和免疫组化试剂 应用为主，国外进口试剂价格非常昂贵，给患者带来很大的经济负担，不利于在基层普及。 具有自主知识产权的国产胃蛋白酶原II(PGII)免疫化学发光检测试剂盒目前还较少，也 仅停留在96孔微孔板式技术水平上。该技术灵敏度较低、线性窄、特异性较差，也不利于高 通量的全自动检测。 因此，有待开发对胃蛋白酶原II(PGII)检测灵敏度高与可靠性并能降低检测成 本的检测技术。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供一种新的可定量检测胃蛋白酶 原II(PGII)的试剂盒，提高检测灵敏度及可靠性，并降低成本，延长有效期。 为了解决上述技术问题，本专利技术提供了如下的技术方案： -方面，本专利技术提供了一种胃蛋白酶原II(PGII)定量测定试剂盒，该试剂盒包括 校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂和发光底物。 其中： -、胃蛋白酶原II(PGII)校准品、胃蛋白酶原II(PGII)质控品的配制方法如下：用标准品缓冲液溶解胃蛋白酶原II(PGII)，配置胃蛋白酶原II(PGII)校准品、 胃蛋白酶原II(PGII)校准品，其中，所述校准品缓冲液是通过在1L新生牛血清中加入 0.Olg~0. 05g的四环素和0.lg~0. 5g硫酸新霉素，溶解后经过0. 22μm滤膜处理制备； 二、抗试剂的制备方法如下：(1)、抗试剂缓冲液的制备： Tris :12. 12mg~60. 57mg，四环素：0·Olg~0· 05g，绵羊血清：lg~5g，新生牛血 清3g~10g，马血清lg~5g加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解； (2)、异硫氰酸荧光素与胃蛋白酶原II(PGII)的偶联，获得异硫氰酸荧光素标记 的胃蛋白酶原II(PGII)包被抗体： 首先用抗试剂缓冲液将异硫氰酸突光素配制成浓度为1. 0~5. Omg/mL的异硫氰 酸荧光素溶液，使用分光光度计在495nm处读取吸光值，来调整浓度，然后按照胃蛋白酶原 II(PGII)抗体与异硫氰酸荧光素的质量之比为1:1. 1，将二者同时转移到棕色玻璃瓶中， 室温下搅拌1~2小时，充分反应后使用pH= 8~9的碳酸氢盐缓冲液进行平衡，然后凝 胶层析分离纯化得到的异硫氰酸荧光素标记的胃蛋白酶原II(PGII)包被抗体；紫外监测， 记录仪记录纯化图谱，同时注意确认含有连接物的试管，注意、避光防护。(3)、碱性磷酸酶与胃蛋白酶原II(PGII)抗体的偶联，获得碱性磷酸酶标记的胃 蛋白酶原II(PGII)标记抗体： 首先用抗试剂缓冲液将碱性磷酸酶配制成浓度为1. 0~5. Omg/mL的碱性磷酸酶 溶液，可以根据分光光度计在280nm处读取吸光值，将碱性磷酸酶的吸光值应该在一定的 范围内。然后按照碱性磷酸酶与胃蛋白酶原Π(PGII)的摩尔比为1:2~1:10的量将二者 转移至棕色瓶中，室温下搅拌4~5小时，充分反应后使用pH= 8~9的碳酸氢盐缓冲液平 衡，然后使用凝胶层析分离纯化得到的碱性磷酸酶标记的胃蛋白酶原II(PGII)标记抗体； 注意含有连接物的试管的避光防护。(4)、将步骤⑵中获得的异硫氰酸荧光素标记的胃蛋白酶原II(PGII)包被抗体 和和步骤（3)中获得的碱性磷酸酶标记的胃蛋白酶原II(PGII)标记抗体，加入含有表面活 性剂的Tris盐缓冲液充，分搅拌后获得所述抗试剂；所述表面活性剂为Tween20、Triton X-100、Bronidox中的一种或多种，表面活性剂的添加量为0. 01%~0. 5%。 三、磁微粒试剂的制备： 将抗异硫氰酸荧光素抗体与羧基磁珠偶联制得磁微粒试剂。 (1)、取一定体积的充分混匀后的羧基磁珠浓缩液至反应瓶中，将该反应瓶在磁场 放置15min，待羧基磁珠全部沉降后吸去上清，向反应瓶中加入2~5倍于反应瓶中羧基磁 珠体积的磁微粒缓冲液，混匀20-30min。再将反应瓶置于磁场中15min后吸去上清。重复 清洗羧基磁珠3遍。最后将羧基磁珠溶液定容到10-50mg/mL，混匀；所述磁微粒缓冲液的 配置方法是：Tris :12. 12mg，氯化钠5. 82mg，甲基纤维醚50g，加入1L纯化水中，充分搅拌 至完全溶解；(2)、连接反应：按照羧基磁珠与抗异硫氰酸荧光素抗体质量比为100:1的比例， 在羧基磁珠中加入抗异硫氰酸荧光素抗体，2~8°C内保持混匀状态反应18小时； (3)、反应瓶在在磁场放置15min，待羧基磁珠沉降后用磷酸缓冲液清洗3遍，然后 定容至10mg/mL，2~8°C保存，制得所需待用磁微粒试剂。 四、发光底物的制备 将ALPS溶解于发光底物缓冲液中制备发光底物。 用4~10倍于ALPS体积的发光底物缓冲液充分溶解ALPS，所述发光底物缓冲液 的配置方法是：Tris12. 12g~121. 14g，氯化钠5. 82g，光泽精0. 03g，加入1L纯化水中，充 分搅拌至完全溶解，用盐酸调节缓冲液的pH至9. 5。 进一步的，本专利技术的胃蛋白酶原II(PGII)定量测定试剂盒，该试剂盒还包括清洗 液。该清洗液主要用于在检测过程中清洗与磁微粒试剂反应后的样品，清洗液的具体组分 可以参照所属领域的常规操作进行。通常是磷酸二氢钠、氯化纳、Tween20和ProcLin300的 混合溶液，在试剂盒制品中可以浓缩清洗液的形式存在，检测时适当稀释后使用。优选的清 洗液的配置方法是：Tris12. 12g，氯化钠5. 82g，Tween-2050mL，曲拉通-100, 50mL，加入1L 纯化水中，充分搅拌至完全溶解。 另一方面，本专利技术提供了这种胃蛋白酶原II(PGII)定量测定试剂盒的制备方法， 包括以下步骤。 分别配制胃蛋白酶原II(PGII)校准品、胃蛋白酶原I本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种胃蛋白酶原II定量测定试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂和发光底物；所述试剂盒中各组分按照如下方法制备：一、校准品、质控品的配制：用校准品缓冲液溶解胃蛋白酶原II，配置胃蛋白酶原II校准品和胃蛋白酶原II质控品；其中，所述校准品缓冲液是通过在1L新生牛血清中加入0.01g～0.05g的四环素和0.1g～0.5g硫酸新霉素，溶解后经过0.22μm滤膜处理制备；二、抗试剂的配制：(1)、抗试剂缓冲液的制备：Tris：12.12mg～60.57mg，四环素：0.01g～0.05g，绵羊血清：1g～5g，新生牛血清3g～10g，马血清1g～5g加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解；(2)、将异硫氰酸荧光素标记的胃蛋白酶原II包被抗体和碱性磷酸酶标记的胃蛋白酶原II标记抗体加入到所述述抗试剂缓冲液中充分搅拌至完全溶解；三、磁微粒试剂的制备：将抗异硫氰酸荧光素抗体与羧基磁珠偶联制得磁微粒试剂；四、发光底物的制备将ALPS溶解于发光底物缓冲液中制得发光底物。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：夏振伟，杨旻，汪丹，
申请(专利权)人：江苏泽成生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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