一种胃蛋白酶原Ⅱ的检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种胃蛋白酶原Ⅱ的检测方法及试剂盒，尤其涉及一种胃蛋白酶原Ⅱ的双波长荧光免疫层析检测方法及其检测试剂盒。包括以下步骤：1)免疫层析试纸条制备；2)冻干探针制备；3)样品稀释液制备；4)样品检验；本发明专利技术的胃蛋白酶原Ⅱ的检测方法及试剂盒，灵敏度高、准确度高、操作简单、成本低。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种胃蛋白酶原Ⅱ的检测方法及试剂盒，尤其涉及一种胃蛋白酶原Ⅱ的双波长荧光免疫层析检测方法及其检测试剂盒。包括以下步骤：1)免疫层析试纸条制备；2)冻干探针制备；3)样品稀释液制备；4)样品检验；本专利技术的胃蛋白酶原Ⅱ的检测方法及试剂盒，灵敏度高、准确度高、操作简单、成本低。【专利说明】-种胃蛋白酶原II的检测方法及试剂盒
本专利技术设及一种胃蛋白酶原II的检测方法及试剂盒，尤其设及一种胃蛋白酶原II 的双波长巧光免疫层析检测方法及其检测试剂盒。
技术介绍
胃蛋白酶原（PG)是胃蛋白酶的前体，是分子量为42000Da的单链多态，依据其生 化性质和免疫原性将其分成两个亚群。组分1-5的免疫原性相同称PG I，主要由胃腺的主 细胞和黏液颈细胞分泌，大部分进入胃腔；组分6-7称PG II，由胃体的胃底黏膜的泌酸腺 的主细胞、泌酸腺的黏液颈细胞、责口腺和胃窦的幽口腺的黏液细胞W及十二指肠上段的 Brunner腺分泌。正常情况下约1%的PG进入血液循环，进入的量十分稳定，因此血清中PG 含量可W反映胃黏膜腺体和细胞的数量，也间接反映了胃黏膜不同部位的分泌功能。当胃 黏膜发生病理变化时，血清PG含量也随之改变，被称为胃黏膜的"血清学活检"。 [000引其中，胃蛋白酶原II (简称PG II )来源于全胃腺和远端十二指肠Brunner氏腺， 其含量的变化可W直接反映胃粘膜和十二指肠状态和细胞数量的变化。国内外临床研究 指出，当萎缩性胃炎伴有肠化、胃窦腺假幽口腺化生，PG II含量会随之升高。通过PG II的 血清检测，有助于检测出与幽口螺旋杆菌感染、胃溃瘍、十二指肠溃瘍W及胃窦部有关的疾 病。血清检测作为非入侵式方法，能够减轻患者的痛苦，而且检测方便、经济，适用于一般的 体检。 目前PG II的主要检测方法有酶联免疫吸附法巧LISA)和化学发光免疫测定 (CLIAKELISA法检测精确、能准确定量，具有很高的敏感性，但是检测样品需要加样、温浴、 洗漆、显色、终止等步骤，操作程序繁琐，耗时长，样品从处理到得出结论需要至少40min，不 适于大规模的体检筛查；样品检测需要洗板机和酶标仪，携带不便，因而不能在病人家庭或 急救车上进行检测；另外其敏感性、特异性不够高，对低浓度样品检测的准确度不高。而化 学发光免疫测定，虽然精确度高、检测速度快，但检测需要昂贵的化学发光免疫分析仪，要 求特定的分析室，另外其试剂成本也较高，无法广泛用于较基层的医院和医疗机构中。 中国专利公布号为CN102654501A的专利技术专利，虽然公布了一种光激发化学发光 检测胃蛋白酶原II的方法，利用单线态离子氧的产生和传递，将能量传递给发光微粒产生 巧光，通过检测巧光强度获得数据。然而采用该专利技术检测样品时需要的操作较多，需要 配套设备，检测复杂，对操作人员的要求较高；而且该专利中的试剂盒制作成本较高，程序 较复杂。中国专利公布号为CN103713140A的专利技术专利，虽然公布了一种消除乳糜干扰的胶 乳免疫比浊法检测胃蛋白酶原II的试剂盒，通过胶乳凝集作用放大样本中待测物质与特异 性抗体的结合反应，添加乳糜消除剂处理产生浑浊的物质，消除其干扰。然而该专利只能消 除一些浑浊类物质的干扰作用，并未消除一些非特异性结合，检测结果可能会高于实际浓 度。中国专利公布号为CN102426236A的专利技术专利，虽然公布了一种将化学发光技术与免疫 磁微粒结合的方法检测胃蛋白酶原II，在本质上还是一种酶联免疫检测技术，操作过程复 杂，检测时间长。 有鉴于上述的缺陷，本设计人，积极加W研究创新，W期创设一种灵敏度高、准确 度高、操作简单、成本低的检测方法及试剂盒，使其更具有产业上的利用价值。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种灵敏度高、准确度高、操作简单、 成本低的胃蛋白酶原II的检测方法及试剂盒。 [000引本专利技术的胃蛋白酶原II的双波长巧光免疫层析检测方法，包括W下步骤： 1)免疫层析试纸条制备；将胃蛋白酶原II单克隆抗体和鸡I巧分别包被在层析试 纸的检测线和控制线上，经干燥、切割后得到免疫层析试纸条； 。冻干探针制备；将两种不同发射光波长的巧光胶乳微粒溶液按比例混合，混合 均匀后加入活化剂反应一段时间，离屯、、洗漆后得到活化巧光胶乳微粒； 将胃蛋白酶原II单克隆抗体和羊抗鸡I巧分别按比例与活化巧光胶乳微粒偶联 反应一段时间，得到胃蛋白酶原II单克隆抗体巧光胶乳微粒、W及羊抗鸡I巧巧光胶乳微 粒； 随后将胃蛋白酶原II单克隆抗体巧光胶乳微粒与羊抗鸡I巧巧光胶乳微粒按一 定比例混合得到混合巧光胶乳微粒，随后加入娃藻糖水溶液稀释，冻干后保存为冻干探 针； 3)样品稀释液制备；样品稀释液为含有牛血清白蛋白、蛋白保护剂、表面活性剂 和防腐剂的缓冲液； 4)样品检验；将血清样品与冻干探针混合分散一段时间后，取出一定量加入样品 稀释液中，待混合均匀后滴加至免疫层析试纸条上进行免疫层析反应；随后在巧光检测器 下采用与两种巧光胶乳微粒相对应的两种发射光波长进行巧光检测。 具体的，所述冻干探针制备步骤中，将两种不同发射光波长的巧光胶乳微粒溶液 按1:5?5:1比例混合，混合均匀后加入活化剂1-(3-二甲氨基丙基）-3-己基碳二亚胺盐 酸盐室温下反应0. 5?化，其中，1-(3-二甲氨基丙基）-3-己基碳二亚胺盐酸盐与巧光胶 乳微粒的重量比为0. 5:100?5:100。 具体的，所述冻干探针制备步骤中，所述两种巧光胶乳微粒的发射光波长分别为 500 ?590nm 和 600 ?740nm。 具体的，所述冻干探针制备步骤中，胃蛋白酶原II单克隆抗体与活化巧光胶乳微 粒的混合比例为0. 01:100?0. 05:100,混合后室温下偶联反应2?化；羊抗鸡I巧与活化 巧光胶乳微粒的混合比例为0. 01:100?0. 05:100,混合后室温下偶联反应2?化。 [001引具体的，所述冻干探针制备步骤中，按3:1?6:1的比例混合胃蛋白酶原II单克 隆抗体巧光胶乳微粒和羊抗鸡I巧巧光胶乳微粒，得到混合巧光胶乳微粒，将混合巧光胶 乳微粒用含糖量5?30%的娃藻糖水溶液稀释10?50倍，在-80°C下冷冻化，取出后 在-30?-50°C冷阱温度下冷冻干燥10?20h，密封保存于4°C。 具体的，所述样品稀释液制备步骤中，所述缓冲液包括PBS缓冲液、Tris缓冲液、 甘氨酸缓冲液、MES缓冲液、肥阳S缓冲液中的一种或几种，所述表面活性剂为吐温20、吐温 80、曲拉通X-100或聚己二醇，所述防腐剂为叠氮钢或proclin。 本专利技术的胃蛋白酶原II的双波长巧光免疫层析检测试剂盒，包括试剂盒体、冻存 管、w及稀释液瓶，所述试剂盒体包括塑料衬板w及固定在塑料衬板上的样品垫、免疫层析 试纸条和吸水纸，所述样品垫和吸水纸分别搭接在所述免疫层析试纸条的两侧，所述免疫 层析试纸条上设置有检测线和控制线，所述检测线和控制线内分别包被有胃蛋白酶原II单 克隆抗体和鸡I巧；所述冻存管中存放有冻干探针，所述冻干探针为由胃蛋白酶原II单克 隆抗体和羊抗鸡I巧与两种不同发射光波长的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胃蛋白酶原Ⅱ的双波长荧光免疫层析检测方法，其特征在于：包括以下步骤：1)免疫层析试纸条制备：将胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体和鸡IgY分别包被在层析试纸的检测线和控制线上，经干燥、切割后得到免疫层析试纸条；2)冻干探针制备：将两种不同发射光波长的荧光胶乳微粒溶液按比例混合，混合均匀后加入活化剂反应一段时间，离心、洗涤后得到活化荧光胶乳微粒；将胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体和羊抗鸡IgY分别按比例与活化荧光胶乳微粒偶联反应一段时间，得到胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体荧光胶乳微粒、以及羊抗鸡IgY荧光胶乳微粒；随后将胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体荧光胶乳微粒与羊抗鸡IgY荧光胶乳微粒按一定比例混合得到混合荧光胶乳微粒，随后加入硅藻糖水溶液稀释，冻干后保存为冻干探针；3)样品稀释液制备：样品稀释液为含有牛血清白蛋白、蛋白保护剂、表面活性剂和防腐剂的缓冲液；4)样品检验：将血清样品与冻干探针混合分散一段时间后，取出一定量加入样品稀释液中，待混合均匀后滴加至免疫层析试纸条上进行免疫层析反应；随后在荧光检测器下采用与两种荧光胶乳微粒相对应的两种发射光波长进行荧光检测。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张鹏，张翼飞，廖平璋，张华，
申请(专利权)人：江苏宏泰格尔生物医学工程有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32