酶检测装置制造方法及图纸

本发明专利技术涉及一种用于检测测试样品中酶活性的酶检测装置。本发明专利技术也涉及用于检测测试样品中的酶活性特别是酶裂解活性的指示分子，和用于检测酶活性存在的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】酶检测装置
本专利技术涉及一种酶检测装置，尽管并非是专门地，特别涉及一种用于检测测试样品中酶活性的装置。本专利技术也涉及用于检测测试样品中酶活性的指示分子和用于检测测试样品中酶活性存在的方法。专利技术背景酶组成参与生物体内催化化学反应的蛋白质家族。由于它们的重要性，大量情形中测量酶水平，以及重要地，酶活性是必须和/或有益的。特别是已发现酶活性的增加与特定的健康状况和/或疾病相关。例如，升高的蛋白酶活性与癌症进展的许多方面有关联。因此，测量取自具有特别健康状况或疑似具有特定健康状况或疾病的个体的样品中的酶活性可能对预后目的或诊断目的是有用的。在酶家族内，有六个酶的主要类别：氧化还原酶；转移酶；水解酶；裂解酶；异构酶和连接酶。这种分类是基于每个类别内的酶催化的反应类型。例如，水解酶通常催化它们底物内的化学键的水解，尤其(interalia)包括例如蛋白酶、肽酶、脂酶和核酸酶的酶。之前已经建立了测量酶活性的试验；然而，经常关联有问题或局限。例如，一些酶检测装置仅用于测量裂解其底物的酶的活性。US2006/0003394中描述了这样的装置，包括试剂盒，含有底物-报告子“反应复合物”，其被加至已知或疑似含有所述酶的测试样品。所述酶-反应复合物施加至层析介质，于是在一个上游位置出现反应复合物的固定。如果所述底物被测试样品内存在的酶裂解，反应复合物的报告部分被释放并流动至下游位置，在那里它能够被单独检测。由于酶活性的检测是基于来自原反应复合物的报告“离开基团”的测量，因此这种装置一点也不适合于测量修饰其底物，而不是裂解其底物的酶的活性。例如，转移酶催化转移例如磷酸基团的功能基团至它们的底物，这样就不能够使用US2006/0003394描述的装置检测。已经描述了不同的适合于检测修饰底物的酶的活性的装置。WO2009/024805中描述了一种这样的装置，其基于使用携带可检测标记的“底物识别分子”(SRM)，其中所述SRM特异地结合至未修饰或修饰状态的酶底物。如WO2009/024805中描述的测定，经常需要适合于区分修饰和未修饰两种形式的酶底物和有效检测的非常特异的检测试剂。使用这种装置获得的测定结果的精确性和可靠性因此受合适试剂的可用性所限。专利技术概述本专利技术通过提供一种用于精确检测测试样品中酶活性的标准化、鲁棒装置，寻求解决与现有酶检测装置相关的至少有些问题。本专利技术特别提供一种装置，其中在两相中有效进行酶活性的检测。在第一相中，试剂用于区分酶底物的修饰的和未修饰形式，在第二相，测量这其中任一种或两种形式的检测以确定酶活性。本装置给出一种测量测试样品中酶活性的标准分析模式，其能够容易地适配于测量任意相关酶的活性。本专利技术也提供一种指示分子，用于检测测试样品中的酶活性。根据本专利技术的第一方面，提供一种用于检测测试样品中酶活性的指示分子，包括：(i)酶可修饰区域(anenzymemodifiableregion)，能够被所述酶修饰，引起该区域从未修饰状态向修饰状态的转变；(ii)间隔开的捕获位点，不论酶可修饰区域的修饰状态如何，该捕获位点可以被捕获分子结合；和(iii)间隔开的检测位点。在某些实施方式中，所述指示分子的酶可修饰区域包括裂解位点，以使得该指示分子用于检测能够裂解其底物的酶的活性。在裂解位点的裂解引起酶可修饰区域从未修饰状态转变至修饰状态，也引起指示分子的片段的释放，该片段由所述检测位点组成，基本由其组成，或包括所述检测位点。所述酶或待检测酶可选自如下种类：氧化还原酶、水解酶和裂解酶，并包括蛋白酶、肽酶、脂酶、核酸酶、糖酶、磷酸酶(phosphatase)、硫酸酯酶、神经氨酸苷酶、酯酶、DNA酶和RNA酶的亚种。在优选实施方式中，所述指示分子用于检测蛋白酶活性。在本专利技术的某些实施方式中，所述酶可修饰区域可以包括多个裂解位点，其中在任何一个位点的裂解引起检测位点从指示分子的捕获位点分离。在本专利技术的文本中，术语“多个”指至少两个、至少三个、至少四个等等。因此，本专利技术提供一种用于测试样品中酶裂解活性检测的指示分子，包括：(i)包括多个裂解位点的酶可修饰区域，其中任何一个裂解位点的裂解引起该区域从非修饰状态向修饰状态的转变；(ii)间隔开的捕获位点，不论该酶的可修饰区域的修饰状态如何，该捕获位点可以被捕获分子结合；和(iii)间隔开的检测位点。在某些实施方式，所述指示分子包括2、3、4、5和10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、100、500或1000个之间的裂解位点。在某些实施方式，所述指示分子包括2和5、6、7、8、9或10个之间的裂解位点。在一个实施方式中，多个裂解位点可以都是相同的。在这种配置中，重复的裂解位点可以相对非特异或可以对如上限定的一种酶或酶亚型高度特异。此外，使用这种类型的指示分子可以通过提供增加测试样品内存在的裂解位点的浓度的方式而有助于提高所述酶检测装置的灵敏性。在其他实施方式中，所述指示分子可以包括多个裂解位点，其中在相同指示分子内存在至少两个不同的裂解位点。在本专利技术的优选实施方式中，所述指示分子可以包括至少3个、至少4个、至少5个，和达至少8个不同的裂解位点。在进一步优选的实施方式中，所述不同的裂解位点被如上定义的不同的酶或不同的种类、亚种或亚型的酶识别，以使得本专利技术的装置能够用于检测多种不同的酶的活性。所述活性可以分组，以使酶活性的检测提供有用的结果。例如，可以是涉及疾病状态的一组酶，这样所述酶组的一个或多个的相关活性的检测具有诊断意义。使用多个裂解位点(不论相同或不相同)可以对待检测测试样品中酶活性非常低的情况特别有用。例如，以上定义的具有多个裂解位点的指示分子可以用于检测含有低水平蛋白酶的尿液样品中的酶活性。一旦根据本专利技术第一方面的指示分子被裂解，可使用本领域技术人员已知的合适方式检测所述检测位点。在某些实施方式中，所述检测位点本身可包括报告基团(moiety)，其中报告基团这里定义为任意能够生成或产生信号的基团。在本专利技术的优选实施方式中，所述报告基团从如下选择：-金颗粒、发色团、发光化合物、荧光分子、放射化合物、可视化合物、脂质体或其他包含信号生成物质的囊泡、电活性物质、或酶和其底物的组合。用作报告基团的合适的酶-底物组合可以是碱性磷酸酶和底物5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐。可选地，或另外地，检测位点可以被本文下述的单独的报告分子结合。这里描述的指示分子可以与根据本专利技术的酶检测装置协同使用。根据本专利技术的第二方面，提供一种用于检测测试样品中酶活性的酶检测装置，包括：(i)加入样品中的指示分子，所述指示分子包括：(a)酶可修饰区域，能够被所述酶修饰，引起该区域从非修饰状态到修饰状态的转变；和(b)检测区域，不论该酶修饰区域的修饰状态如何，该检测区域不被该酶修饰和能够被报告分子结合；(ii)接收测试样品的选择性捕获区域(detectionzone)，其中，该选择性捕获带包含能够选择性地结合处于修饰或非修饰的任一种状态的指示分子的酶可修饰区域的选择性识别分子；和(iii)接收与选择性捕获带接触后的测试样品的检测带，其中，检测带与选择性捕获带空间上间隔开，以使得测试样品对检测带的暴露发生在测试样品对选择性捕获带的预暴露后，其中只有那些不结合选择性捕本文档来自技高网...

【技术保护点】
在用于检测测试样品中酶裂解活性的指示分子，包括：(i)包括多个裂解位点的酶可修饰区域，其中任何一个裂解位点的裂解引起该区域从非修饰状态向修饰状态转变；(ii)间隔开的捕获位点，不论该酶的可修饰区域的状态如何，该捕获位点可以被捕获分子结合；和(iii)间隔开的检测位点。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.04.20 GB 1206977.91.用于检测测试样品中酶活性的酶检测装置，包括：(i)加入样品中的指示分子，该指示分子包括：(a)酶可修饰区域，该区域能够被所述酶修饰，引起该区域从非修饰到修饰状态的转变；(b)检测区域；不论该酶可修饰区域的修饰状态如何，该区域未被所述酶修饰和能够被报告分子结合，其中，不论该酶可修饰区域的修饰状态如何，该检测区域还包括一捕获位点，该捕获位点能够被捕获分子结合；和(ii)用来接收测试样品的选择性捕获区域，其中，该选择性捕获区域包括能够选择性地结合处于修饰或未修饰任一状态中的指示分子的酶可修饰区域的选择性识别分子；和(iii)用来接收与选择捕获区域接触后的测试样品的检测区域，其中，检测区域与选择性捕获区域空间上间隔开从而向检测区域暴露测试样品发生在先向选择性捕获区域暴露测试样品之后，其中，检测区域包括能够特异结合指示分子的捕获位点的捕获分子，如果指示分子存在的话，和其中，只有那些不结合选择性捕获区域中的选择性识别分子的指示分子进入检测区域，其中，所述指示分子在选择性捕获区域和/或检测区域上被检测。2.根据权利要求1所述的装置，其中，指示分子的酶可修饰区域包括肽、蛋白、碳水化合物、脂质或核酸。3.根据权利要求1所述的装置，其中被检测的酶选自如下种类：氧化还原酶，转移酶，水解酶，裂解酶，异构酶和连接酶。4.根据权利要求1所述的装置，其中被检测的酶选自如下种类：蛋白酶、肽酶、脂肪酶、核酸酶、糖酶、磷酸酶、神经氨酸苷酶、唾液酸苷酶、酯酶、激酶、甘油转移酶、氧化酶、还原酶和转氨酶的亚种。5.根据权利要求1所述的装置，其中，被检测的酶为金属蛋白酶或者人中性粒细胞衍生的弹性蛋白酶。6.根据权利要求1所述的装置，其中，选择性识别分子为抗体或其抗原结合片段；生物素，链酶亲和素或它们的衍生物；凝集素；核酸分子；受体分子或激素结合蛋白。7.根据权利要求1所述的装置，其中，一旦所述指示分子被选择性识别分子结合，所述酶可修饰区域不能够被所述酶修饰。8.根据权利要求1所述的装置，其中，捕获位点和捕获分子为结合对中的两半，其中，所述的结合对的两半选自如下的结合对：抗原和抗体或者它们的结合片段；生物素和亲和素，链霉亲和素，中性亲和素或captavidin；免疫球蛋白或其合适的域和蛋白A或G；碳水化合物和凝集素；核苷酸序列互补的序列；配体和受体分子；激素和激素结合蛋白；酶辅助因子和酶；酶的抑制剂和酶；纤维素结合区域和纤维素纤维；固定的氨基苯基硼酸和具有顺式-二醇的分子；木葡聚糖和纤维素纤维；和它们的类似物，衍生物以及片段。9.根据权利要求1所述的装置，其中，另外包括结合至指示分子的检测区域或者能够结合指示分子的检测区域的报告分子。10.根据权利要求9所述的装置，其中，所述指示分子的检测区域包括与捕获位点不同并且空间上间隔开的检测位点，和所述报告分子通过所述检测位点结合至检测区域。11.根据权利要求9所述的装置，其中，所述报告分子通过捕获位点结合到检测区域上，其中报告分...

【专利技术属性】
技术研发人员：保罗·大卫，凯特·帕克，
申请(专利权)人：莫洛克有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB