本发明专利技术涉及一种耐高温蛋白酶及其菌株选育方法和在酶解中的应用方法。该耐高温蛋白酶在20～80℃的条件下具有活性和较高的热稳定性；所述耐高温蛋白酶是由毕赤酵母发酵产出。用于发酵产出耐高温蛋白酶的毕赤酵，分类命名为巴斯德毕赤酵母MMpk-GS115。菌株选育方法包括：准备白色侧齿霉菌、毕赤酵母表达载体构建等步骤。耐高温蛋白酶在酶解中的应用方法是先将耐高温蛋白酶制备成耐高温蛋白酶粗酶，然后将酶解基料以耐高温蛋白酶粗酶进行酶解。本发明专利技术的优点是：该耐高温蛋白酶菌株能够产胞外蛋白酶，具有产酶活性高、发酵时间短，蛋白酶切割位点具有广泛特异性；在大米粕、豆粕、白酒糟、构树叶等植物蛋白及酵母培养物的酶解后，小肽含量达到10～50%，能改善植物蛋白，或酵母培养物品质，提高营养价值，更易于动物消化吸收。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，具体是一种毕赤酵母所产的耐高温蛋白酶及其菌株选育方法和在植物蛋白及酵母培养物酶解中的应用方法，特别适用于饲料及保健食品行业，属于发酵工程
。
技术介绍
工业用酶制剂中75%是蛋白水解酶，而蛋白酶是工业用酶中占据比例最大的酶类，大约占全世界每年总销售量的60%左右。蛋白酶在饲料、洗涤剂、食品、医药和皮革制造等行业中有着广泛的用途。蛋白酶菌株的选育方法有物理、化学因子单独或复合诱变、原生质体技术、基因工程技术等。现有技术存在的缺点是:利用基因工程技术构建产蛋白酶工程菌的过程中容易发生基因突变，而且基因工程菌可能无法正确翻译外源蛋白酶基因等。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是:提供一种耐高温蛋白酶，该高温蛋白酶是由毕赤酵母所产生，能闻效酶解大米柏、?柏、白酒糟、构树叶等植物蛋白及酵母培养物，改善其品质，提闻营养价值，改善溶解性、起泡性等功能特性，从而提高了动物对植物蛋白及酵母培养物饲料的利用效率。该耐高温蛋白酶切割位点广泛，应用范围甚广，可应用于大多数植物蛋白。本专利技术的另一个目的是:提供耐高温蛋白酶菌株的选育方法，该方法能够利用甲醇作为唯一碳源高效表 达耐高温蛋白酶并分泌到胞外，且分泌很少的自身蛋白，还可以对外源蛋白进行翻译后修饰。本专利技术的还有一个目的是:提供耐高温蛋白酶在植物蛋白及酵母培养物酶解中的应用方法，具体是对大米柏、豆柏、白酒糟、构树叶等植物蛋白及酵母培养物进行酶解的方法，获得含有大量小肽或氨基酸的产品，改善植物蛋白品质，提高营养价值及动物吸收利用率。培养物水解效率高，反应条件温和，产生毒性物质的可能性小，同时随着酶反应的进行，蛋白质的相对分子质量逐渐变小，并转化为肽或者氨基酸，更易于消化吸收。本专利技术一种耐高温蛋白酶的技术方案是:该耐高温蛋白酶在20~80°C的条件下具有活性和较高的热稳定性，在65°C条件下，活性可保持3 h不变，在40~50°C的条件下，24 h仍有60%以上的活性；在pH 6~11范围内均有活性，当pH7~9时24h内酶活性保存率为100% ;所述耐高温蛋白酶菌株由毕赤酵母通过基因工程手段改造而成。—种用于发酵产出本专利技术所述耐高温蛋白酶的毕赤酵母，其分类命名为巴斯德毕赤酵母 MMpk_GS115 iPichia pas tor is MMpk~GS115 )，保藏中心保藏编号为:CCTCC NO: M2014171，保藏日期为:2014年4月28日，保藏单位为:中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址:武汉市武昌珞珈山武汉大学；所述巴斯德毕赤酵母遍形态及生理生化特征包括:呈乳白色，菌体镜检呈椭圆形或园形，为甲醇营养型菌。所述一种用于发酵产出耐高温蛋白酶的毕赤酵母，通过甲醇补料发酵后，发酵液蛋白酶活力大于等于50000U/mL，小于等于100000U/mL，比活力大于等于3000U/mg，小于等于 5000U/mg。一种耐高温蛋白酶菌株选育方法，包括下述步骤: A、准备白色侧齿霉菌用作耐高温蛋白酶基因序列来源； B、利用重叠延伸PCR技术获得目的基因序列沙左，即采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来； C、将目的基因插入表达载体:插入构建的常规的毕赤酵母表达载体p9kNTS、p9kMFII: D、将上述表达载体的重组和线性化； E、电转化巴斯德毕赤酵母MMpk-GSl15:经重组和线性化后，电转化； F、初筛、复筛，最后获得一株耐闻温蛋白酶菌株。所述的D步骤初筛、复筛是:摇瓶酶活测定筛选，以筛选到的酶活相对很高的酵母工程p9kNTS-Fpk-GS115作为宿主菌，将重组质粒p9kNTS_Fpk、p9kMF I1-Fpk线性化后进行二次电转化，再进行较高浓度的G418梯度高拷贝筛选，酶活测定筛选，获得一株耐高温蛋白酶的菌株。本专利技术一种耐高温蛋白酶在酶解中的应用方法，先将耐高温蛋白酶制备成耐高温蛋白酶粗酶，然后将酶解基料以耐高温蛋白酶粗酶进行酶解，该酶解的步骤包括: 首先，将酶解基料加水拌均，加水量按重量计，干酶解基料与水的比为1:1~9，调整PH6~9，然后在温度为55~65°C条件下加入耐高温蛋白酶粗酶，加入量为300~5000U/g干酶解基料；再发酵酶解，时间为3~36 h，最后得到液态的酶解的蛋白质，或经干燥得到干的酶解的蛋白质； 所述的酶解基料为发酵植物蛋白，或酵母培养物；所述发酵植物蛋白包括大米柏、豆柏、白酒糟、构树叶。一种本专利技术所述的耐高温蛋白酶在酶解大米柏中的应用方法，其酶解基料为大米柏，以耐高温蛋白酶粗酶进行酶解的步骤为:首先，将酶解基料加水拌均，加水量按重量计，基料与水的比为1: 9，调整pH8，在60°C条件下加入耐高温蛋白酶粗酶，加入量为5000U/g干酶解基料；再发酵酶解，时间为3h。一种本专利技术所述的耐高温蛋白酶在酶解豆柏中的应用方法，其酶解基料为豆柏，以耐高温蛋白酶粗酶进行酶解的步骤为:首先，将酶解基料加水拌均，加水量按重量计，基料与水的比为1:9，调整PH9，然后在温度为65°C条件下加入耐高温蛋白酶粗酶，加入量为1000U/g干酶解基料；再发酵酶解，时间为16h。一种本专利技术所述的耐高温蛋白酶在酶解白酒糟中的应用方法，其酶解基料为白酒糟，以耐高温蛋白酶粗酶进行酶解的步骤为:首先，将酶解基料加水拌均，加水量按重量计，基料与水的比为1:5，调整pH8，然后在温度为55°C条件下加入耐高温蛋白酶粗酶，加入量为5000U/g干酶解基料；再发酵酶解，时间为12h。一种本专利技术所述的耐高温蛋白酶在酶解构树叶中的应用方法，其酶解基料为构树叶，以耐高温蛋白酶粗酶进行酶解的步骤为:首先，将酶解基料加水拌均，加水量按重量计，基料与水的比为1:9，调整pH为自然状态，然后在温度为60°C条件下加入耐高温蛋白酶粗酶，加入量为1000U/g干酶解基料；再发酵酶解，时间为3h。一种本专利技术所述的耐高温蛋白酶在酶解酵母培养物中的应用方法，其酶解基料为酵母培养物，以耐高温蛋白酶粗酶进行酶解的步骤为:首先，将酶解基料加水拌均，加水量按重量计，基料与水的比为1:7，调整pH8，然后在温度为55°C条件下加入耐高温蛋白酶粗酶，加入量为1000U/g干酶解基料；再发酵酶解，时间为36h。本专利技术具有以下优点: I)本专利技术构建的菌株发酵产生耐高温蛋白酶的粗酶活力可高达50000 U/ml。2)所产耐高温蛋白酶切割位点广泛、耐热性和耐碱性，在20~80°C，pH 6~11范围内均有活性，在亲水性有机溶剂如二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、丙酮和乙醇中仍有较高的活性。耐高温蛋白酶粗酶液保存时间长久。3)本专利技术筛选到的耐高温蛋白酶可以分泌到培养基中，方便纯化，便于工业应用。4)本专利技术的耐高温蛋白酶应用广泛，可降解多种植物蛋白，如豆柏、米柏、植物蛋白酵母培养物、构树叶、酒糟等。5)本专利技术的耐高温蛋白酶可以使植物蛋白及酵母培养物中蛋白质降解率达到60%以上，产物小肽含量达10~50%。用该酶处理植物蛋白和酵母培养物可以改善蛋白品质，提高营养价值，改善溶解性、起泡性等功能特性，更易于动物体消化吸收。【具体实施方式】 : 结合实施例对本专利技术作进一步说明如下: 实施例1:是本本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种耐高温蛋白酶，其特征在于，该耐高温蛋白酶在20～80℃的条件下具有活性和较高的热稳定性，在65℃条件下，活性可保持3 h不变，在40～50℃的条件下，24 h仍有60%以上的活性；在pH 6～11范围内均有活性，当pH7～9 时24h内酶活性保存率为100%；所述耐高温蛋白酶产生菌株是由毕赤酵母通过基因工程手段改造而成。
【技术特征摘要】
1.一种耐高温蛋白酶，其特征在于，该耐高温蛋白酶在20~80°C的条件下具有活性和较高的热稳定性，在65°C条件下，活性可保持3 h不变，在40~50°C的条件下，24 h仍有60%以上的活性；在pH 6~11范围内均有活性，当pH7~9时24h内酶活性保存率为100%;所述耐高温蛋白酶产生菌株是由毕赤酵母通过基因工程手段改造而成。2.一种用于发酵产出权利要求1所述耐高温蛋白酶的毕赤酵母，其特征在于，分类命名为巴斯德毕赤酵母MMpk-GSl 15 {Pi chi a pastor is MMpk-GSl 15 )，保藏中心保藏编号为:CCTCC NO: M 2014171，保藏日期为:2014年4月28日，保藏单位为:中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址:武汉市武昌珞珈山武汉大学；所述巴斯德毕赤酵母遍形态及生理生化特征包括:呈乳白色，菌体镜检呈椭圆形或园形，为甲醇营养型菌。3.根据权利要求2所述的一种用于发酵产出耐高温蛋白酶的毕赤酵母，其特征在于，通过甲醇补料发酵后，发酵液蛋白酶活力大于等于50000U/mL，小于等于100000U/mL，比活力大于等于3000U/mg,小于等于5000U/mg。4.一种权利要求1所述的耐高温蛋白酶菌株选育方法，其特征在于，包括下述步骤: A、准备白色侧齿霉菌用作耐高温蛋白酶基因序列来源； B、利用重叠延伸PCR技术获得目的基因序列沙左，即采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来； C、将目的基因插入表达载体:插入构建的常规的毕赤酵母表达载体p9kNTS、p9kMFII: D、将上述表达载体的重组和线性化； E、电转化巴斯德毕赤酵母MMpk-GSl15:经重组和线性化后，电转化； F、初筛、复筛，最后获得一株耐闻温蛋白酶菌株。5.根据权利要求4所述的耐高温蛋白酶菌株选育方法，其特征在于，所述的D步骤初筛、复筛是:摇瓶酶活测定筛选，以筛选到的酶活相对很高的酵母工程p9kNTS-Fpk-GS115作为宿主菌，将重组质粒p9kNTS-Fpk、p9kMF I1-Fpk线性化后进行二次电转化，再进行较高浓度的G418梯度高拷贝筛选，酶活测定筛选，获得一株耐高温蛋白酶的菌株。6.一种权利要求4或5所述的耐高温蛋白酶在酶解中的应用方法，其特征在于，先将耐高温蛋白酶制备成耐高温蛋白酶...
【专利技术属性】
技术研发人员：葛向阳，彭楠，方玉美，赵述淼，李俊，迟晨，潘超，姜超，梁运祥，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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