基因突变型重组蛋白酶K及其工业化生产方法技术

本发明专利技术涉及一种基因突变型重组蛋白酶K及其工业化生产方法。更具体而言，本发明专利技术涉及一种经过基因改造和蛋白质工程化得到的酶活性为同种天然蛋白酶活性2倍以上的基因突变型重组蛋白酶K；以及利用酵母细胞大规模培养表达外源蛋白，制备所述基因突变型重组蛋白酶K的工业化生产方法和工艺过程。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种基因突变型重组蛋白酶K及其工业化生产方法。更具体而言，本专利技术涉及一种经过基因改造和蛋白质工程化得到的酶活性为同种天然蛋白酶活性2倍以上的基因突变型重组蛋白酶K;以及利用酵母细胞大规模培养表达外源蛋白，制备所述基因突变型重组蛋白酶K的工业化生产方法和工艺过程。
技术介绍
蛋白酶K是一种丝氨酸蛋白酶，于1974年首次在林伯氏白色念球菌(Tritirachium album limber)的提取物中发现(Ebeling W 等，Eur J Biochem. 1974 Aug15;47(1) :91-7)。由于该酶能够消化富含二硫键的天然角蛋白，林伯氏白色念球菌能够以角蛋白作为唯一的碳源/氮源生长，蛋白酶K也由此得名。 蛋白酶K最大的特点在于对天然蛋白质具有广谱高效的切割能力，是现有蛋白酶中活性最高的一种。该酶偏好于切割脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸，特别是丙氨酸的羧基端妝键。此外，蛋白酶K还是一种稳定性非常出色的酶，在pH 4、H 12、20°C 60°C的条件下均有活性，在多种能够使蛋白质变性的化学试剂(如SDS、尿素、螯合剂(如EDTA)及巯基试剂(如胰蛋白酶抑制剂或糜蛋白酶抑制剂))中也具有切割蛋白质的能力。由于细胞裂解过程中通常使用SDS溶液，而蛋白酶K在O. 5% (w/v)的SDS溶液中依然能够维持完全的活性，使得其可应用于核酸提取中，通过快速降解细胞裂解释放出的胞内核酸酶，分离得到完整的核酸片段。在先研究还表明，蛋白酶K在去污剂(如TritonX-100)中也具有出色的稳定性，因而还被广泛用于膜蛋白及跨膜蛋白的研究中。近年来，蛋白酶K的应用并不仅仅局限在医疗诊断及科研领域，在工业制革、造纸、饲料等领域中也可以替代传统的可能存在污染的化学方法处理原材料。因此，得到高活性、低造价的蛋白酶K具有实际意义。然而，天然蛋白酶K依靠传统发酵提取，产量很低，成本较高，不适合今后该产品的大规模运用。因此，目前本领域的研究焦点集中在利用基因工程技术和蛋白质工程技术，改造蛋白质的分子结构，期望得到活性更高、成本更低的蛋白酶K。迄今为止，现有工业化生产的基因重组蛋白酶K是以原核细胞为宿主，譬如大肠杆菌表达系统，其优点是简便、经济。然而，该系统表达得到的蛋白酶K活性不高或者没有活性，达不到天然蛋白酶K的水平，这可能是由于蛋白酶K需要转录或翻译后处理过程，原核系统无法实现这个功能。此外，利用原核细胞进行外源蛋白表达的产量过低，因而难以满足市场需求。此外，若想获得商品化的蛋白酶K产品，下游纯化和冻干技术非常重要，目前在这方面并没有可以借鉴的资料。例如，利用已经报道的纯化方法均不能得到大批量、高产率的蛋白酶K。经过本专利技术人的测试，这些纯化方法在规模化生产中实用价值不高。为解决上述问题，本专利技术人进行了深入的研究，结合了基因突变和真核细胞-酵母外分泌表达技术，从改造蛋白酶K分子结构入手，得到活性提高的基因突变型重组蛋白酶K ;优化表达系统,利用酵母细胞外分泌表达技术,大规模发酵高效表达基因突变型重组蛋白酶K，进一步提高蛋白酶K的活性及产量；采用新型蛋白纯化方式，提高蛋白酶K纯化过程中的收率，从而实现了规模化和连续化生产，完成了本专利技术。目前在专利文件和非专利文件中均未发现关于基因突变型重组蛋白酶K在酵母中工业化生产的报道。
技术实现思路
野生型蛋白酶K前体由384个氨基酸组成(SEQ ID NO. 1，UniProtKB/Swiss-Prot:P06873. 2)，包括15个氨基酸长度的信号肽、90个氨基酸长度的前肽及279个氨基酸长度的成熟蛋白酶K。经过国外科学家研究，相比于野生型蛋白酶K，基因突变型重组蛋白酶K可以具有较高的活性。本专利技术人从野生型蛋白酶K的氨基酸序列(SEQ ID NO. 2，由369个氨基酸组成，包括90个氨基酸长度的前肽及279个氨基酸长度的成熟蛋白酶K)中挑选了八个关键 位点，合成基因并在真核系统表达成功，得到了酶活大大提高的基因突变型重组蛋白酶K。因此，本专利技术的第一方面在于提供一种基因突变型重组蛋白酶K，其特征在于(I)将野生型蛋白酶K氨基酸序列(SEQ ID NO. 2)中第151位的Y突变为A、第208位的K突变为H、第273位的S突变为T、第293位的G突变为A、第332位的K突变为R、第337位的S突变为N ;任选地，还进行下述任意I种以上的突变(2)将第123位的S突变为A ;(3)将第180位的L突变为I。本专利技术另一方面在于提供编码上述基因突变型重组蛋白酶K的DNA。本专利技术另一方面在于提供包含上述DNA的表达载体。本专利技术又一方面在于提供导入上述表达载体的转化细胞。本专利技术再一方面在于提供含有上述基因突变型重组蛋白酶K、DNA、表达载体和/或转化细胞的试剂盒。本专利技术另一方面在于提供利用真核细胞制备上述基因突变型重组蛋白酶K的方法，该方法包含如下步骤在培养基中培养含有本专利技术的基因突变型重组蛋白酶K的转化细胞；以及收集所述培养基中的所述基因突变型重组蛋白酶K，其特征在于，所述转化细胞是酵母细胞。此外，本专利技术人通过选择不同树脂材料脱色、不同层析介质纯化、不同保护剂和冻干工艺冷冻干燥，得到了商品化的基因突变型重组蛋白酶K产品。因此，本专利技术另一方面提供了发酵生产蛋白酶K后，采用新型纯化方式处理提高得率及批量冷冻干燥的技术。附图说明从与附图结合的下列详细描述中，将更清楚地理解本专利技术的上述和其它目的、特征和其它优点，其中图I表示显示本专利技术的基因突变型重组蛋白酶K mutProK6、mutProK7_l、mutProK7-2及mutProK8氨基酸序列中突变位点的概要图。图2表示酵母表达载体PPIC9K的载体图谱。图3表示利用SDS-PAGE检测本专利技术的基因突变型重组蛋白酶K mutProK8在GS115酵母细胞中的表达的结果(实验室规模；摇瓶发酵)。图4表示利用Western印迹检测本专利技术的基因突变型重组蛋白酶K mutProK8在GSl 15酵母细胞中的表达的结果(实验室规模；摇瓶发酵及30L发酵罐发酵)。图5表示基因突变型蛋白酶K mutProK8和野生型蛋白酶K的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果(实验室规模；摇瓶发酵)。图6表示基因突变型蛋白酶K mutProK8消化牛血清白蛋白(BSA)的定性实验结果O 图7表示利用F-C分析法对本专利技术的基因突变型重组蛋白酶K的酶活性进行定性检测时所得到的酪氨酸标准曲线。图8表示利用SDS-PAGE检测2吨发酵罐培养毕赤酵母不同时间产酶量的结果。图9表示利用电泳对经纯化冻干后的基因突变型重组蛋白酶K的纯度进行检测的结果图9A :变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；图9B :非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。图10表示本专利技术的基因突变型重组蛋白酶K的稳定性结果。具体实施例方式下文将详细阐述本专利技术。一 .本专利技术的基因突变型重组蛋白酶K以及活性测定本专利技术的基因突变型重组蛋白酶K，其特征在于(I)将野生型蛋白酶K氨基酸序列(SEQ ID NO. 2)中第151位的Y突变为A、第208位的K突变为H、第273位的S突变为T、第293位的G突变为A、第332位的K突变为R、第337位的S突变为N ;任选地还进行下述任意I种以上的突变(2)将第123位的S突变为A ;(3)将第1本文档来自技高网...

【技术保护点】
基因突变型重组蛋白酶K，其特征在于：将如SEQ？ID？NO.2所示的氨基酸序列第151位的Y突变为A、第208位的K突变为H、第273位的S突变为T、第293位的G突变为A、第332位的K突变为R、第337位的S突变为N。

【技术特征摘要】
1.基因突变型重组蛋白酶K，其特征在于将如SEQID NO. 2所示的氨基酸序列第151位的Y突变为A、第208位的K突变为H、第273位的S突变为T、第293位的G突变为A、第332位的K突变为R、第337位的S突变为N。2.如权利要求I所述的基因突变型重组蛋白酶K，其中，所述基因突变型重组蛋白酶K还具有下述任意一种以上的突变 (1)第123位的S突变为A; (2)第180位的L突变为I。3.如权利要求I或2所述的基因突变型重组蛋白酶K，其中，所述基因突变型重组蛋白酶K的C端还具有六聚组氨酸标签。4.编码如权利要求1-3中任一项所述的基因突变型重组蛋白酶K的DNA。5.如权利要求4所述的DNA，其中，所述DNA为SEQID NO. 6-9所表示的核苷酸序列的全部或部分，所述部分至少具有SEQ ID NO. 6-9第7-1113位的核苷酸序列。6.包含如权利要求4或5所述的DNA的表达载体，其中，所述表达载体优选为pPICZ、pPICZ a、pGAPZ、pGAPZ α、pGAPZ a A 和 pPIC9K。7.导入权利要求6...

【专利技术属性】
技术研发人员：安海谦，鲁刚伟，冉波，任玉珍，
申请(专利权)人：金普诺安生物科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：