重组C-蛋白酶及其加工、方法和用途技术

编码Ｃ－蛋白酶的核酸序列。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
1.相关案例的陈述本申请为1995年8月8日申请的美国临时申请60/002038的后续部分申请。2.介绍胶原除了别的用途外，还是结缔组织适当形成所必需的。因此，胶原的过度产生或产生不足或异常产生(包括不正确加工的胶原)与多种结缔组织疾病和失调有关。因此，控制和/或调节胶原的形成已成为研究的焦点。这些研究包括努力鉴定包括C-蛋白酶(为胶原正确形成和加工的关键)在内的酶。本专利技术涉及编码C-蛋白酶和相应多肽的核苷酸序列的分离和鉴定，涉及这种多肽活性的识别及其应用、工具、加工和使用方法。3.专利技术背景胶原结构，现在已鉴定了十九个类型的胶原。这些胶原(包括I、II和III型纤维胶原)，合成含有氨基末端和羧基末端延伸肽的原胶原前体分子。一般称为“前区(pro-region)”的这些延伸肽分别命名为N-前肽和C-前肽。N-前肽和C-前肽都通常在原胶原三股螺旋前体分子从细胞分泌时被切割，产生成熟的三股螺旋胶原分子。切割后，“成熟”胶原分子能够联合为高级结构的胶原纤维。参见例如Fessler和Fessler，1978，Annu.Rev.Biochem.47129-162；Bornstein和Traub，1979，The Proteins(eds.Neurath，H.和Hill，R.H.)，Academic Press，New York，第412-632页；Kivirikko等，1984，Extracellular Matrix Biochemistry(eds.Piez，K.A.和Reddi，A.H.)，Elsvier Science Publishing Co.，Inc.，New York，第83-118页；Prockop和Kivirikko，1984，N.Engl.J.Med.311376-383；Kuhn，1987，Structure and Function of Collagen Types(eds Mayne，R.和Burgeson，R.E.)，Academic Press，Inc.，Orlando，Florida，第1-42页。与胶原异常产生有关的疾病。一系列危险的疾病都与胶原的不适当或不规则产生有关，包括病理性纤维变化或瘢痕形成，包括心内膜硬化、特发性间质性纤维变性、间质性肺纤维化、肌周纤维变性、Symmer纤维变性、中枢周纤维变性、肝炎、皮肤纤维变性、胆汁性肝硬变、酒精性肝硬变、急性肺纤维化、特发性肺纤维化、急性呼吸窘迫综合症、肾纤维变性/肾小球性肾炎、肾纤维变性/糖尿病性肾炎、硬皮病/全身性、硬皮病/局限性、瘢痕瘤、肥大性瘢、严重关节粘连/关节炎、骨髓纤维变性、角膜瘢痕形成、胰囊纤维变性、肌营养不良(Duchenne病)、心纤维变性、肌纤维变性/视网膜分离、食管狭窄、派尔病(payronles disease)。其它纤维变性失调可以由外科诱导或引发，这些手术包括瘢痕修正/整形外科、青光眼、白内障纤维变性、角膜瘢痕形成、关节粘连、移植物抗宿主病、腱外科、神经包埋、Dupuytren挛缩、OB/GYN粘连/纤维变性、骨盆粘连、硬膜外纤维变性、再狭窄。治疗这些疾病的一个策略是抑制胶原的病理性过度产生。因此，参与胶原产生和加工的酶的鉴定和分离是主要的医药目标，以提供适于药物研制的靶。同样地，由胶原病理性产生不足引起的疾病(这里胶原产生不足是原胶原不正确加工的结果)的治疗策略是给予C-蛋白酶。关于C-蛋白酶的背景资料。C-蛋白酶是一种催化切割纤维性胶原(包括I、II和III型胶原)C-前肽的酶。首先在人和鼠成纤维细胞(Goldbers等，1975，Cell 445-50；Kessler和Goldberg，1978，Anal.Biochem.86463-469)和鸡腱成纤维细胞(Duskin等，1978，Arch.Biochem.Biophys.185326-332；Leung等，1979，J.Biol.Chem.254224-232)的培养基中观察到该酶。也已鉴定了从I型原胶原除去C-末端前肽的酸性蛋白酶。Davidson等，1979，Eur.J.Biochem.100551。1982年由鸡颅盖获得具有C-蛋白酶活性的部分纯化蛋白质。Njieha等，1982，Biochemistry 23757-764。在1985年，从鸡胚腱的条件培养物分离、纯化和表征了天然C-蛋白酶。Hojima等，1985，J.Biol.Chem.26015996-16003。随后从培养的小鼠成纤维细胞的培养物中纯化了鼠C-蛋白酶。Kessler等，1986，Collagen Relat.Res.6249-266；Kessler和Adar，1989，Eur.J.Biochem.186115-121。用这些纯化形式的鸡和鼠C-蛋白酶进行的实验表明，该酶有助于功能胶原纤维的形成。Fertala等，1994，J.Bioil.Chem.26911584。一般来说，已经采用一系列分析测定了C-蛋白酶活性和该酶活性的抑制。参见例如kessler和Goldberg，1978，Anal.Biochem.86463；Njieha等，1982，Biochemistry 21757-764。正如多种出版物中清楚说明的，该酶难以用常规生化方法分离，在本专利技术之前，已知该酶和编码这种酶的cDNA序列都不能得到。Takahara等，1994，J.Biol.Chem.26926280-26285，26284(“尚未获得C-蛋白酶的肽序列和核苷酸序列)。因此，尽管可以利用C-蛋白酶的相关分析，但迄今尚未进行有效的C-蛋白酶抑制剂的大量综述和测试。已知的C-蛋白酶抑制剂。已经鉴定了许多有效的C-蛋白酶抑制剂。例如几种金属螯合剂显示出具有C-蛋白酶抑制剂的活性。同样地，已发现凝乳酶抑制剂(chymostatin)和胃蛋白酶抑制剂A作为相对强的C-蛋白酶活性抑制剂。α2-巨球蛋白、ovostatin和胎牛血清也表现出至少部分抑制C-蛋白酶的活性。同样地，二硫苏糖醇、SDS、伴刀豆球蛋白A、Zn2+、Cu2-和Cd2-低浓度下具有抑制活性，已发现某些还原剂、几种氨基酸(包括赖氨酸和精氨酸)、磷酸盐和硫酸铵在1-10mM浓度下具有C-蛋白酶抑制剂活性。Leung等，supra；Ryhnen等，1982，Arch.Biochem.Biophys.215230-236。我们也发现高浓度的NaCl或Tris-HCl缓冲液抑制C-蛋白酶活性。例如已经报道了0.2M、0.3M和0.5M的NaCl将用0.15M的标准分析浓度观察到的C-蛋白酶活性分别减少66％、38％和25％。同样，已经报道0.2-0.5M的Tris-HCl缓冲液抑制该酶的活性。Hojima等，supra。相反，诸如亮抑制素、phosphoramidon、木瓜蛋白酶抑制剂、bestatin、elastinal和amastatin之类的抑菌剂被认为作用弱或没有作用。关于骨形态发生蛋白-1(BMP-1)的背景资料。1988年，从骨组织中分离了一种具有C-蛋白酶结构特征的蛋白质。在本专利技术之前，由于BMP-1与BMP-2和BMP-3同时分离，因此人们相信命名为BMP-1或“骨形态发生蛋白”的该蛋白为TGF-β相关蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：D·J·普罗科普，Y·霍吉马，S·W·李，A·思龙，
申请(专利权)人：托马斯杰弗逊大学，
类型：发明
国别省市：