本申请涉及分子生物学领域，特别是涉及ATP7B基因突变检测引物组、试剂盒、其检测方法及应用，本发明专利技术的引物组涉及到ATP7B基因的大部分区域，包括外显子和内含子，能较为全面获取患者的ATP7B基因的核苷酸序列情况，明确突变位点；且该引物组针对长片段扩增，在合适条件下扩增出的条带单一，无非特异性条带，且由于扩增片段长，与短片段扩增方法相比测序结果更为均匀，数据分析更为简单。
【技术实现步骤摘要】
本申请涉及分子生物学领域，特别是涉及ATP7B基因突变检测引物组、试剂盒、其检测方法及应用。
技术介绍
肝豆状核变性，又称Wilson Disease(WD)，是一种具有不同发病年龄和不同临床表型的严重的常染色体隐性遗传的铜代谢障碍疾病。国外流行病学调查资料显示，期患病率为1.5-3.0/10万，基因频率为0.3-0.7％。在中国汉族人群中的携带率为1/50。肝豆状核变性最常见的临床表现为肝硬化、神经系统症状和精神症状。肝豆状核变性主要是通过临床表现如肝脏或/和神经系统症状、家族史、角膜色素环、生化检查包括检测血清铜蓝蛋白、24小时尿铜以及基因突变分析等来确诊。肝豆状核变性是目前遗传性疾病中治疗效果较好的，早期诊断并给予控制铜摄入和排铜治疗，对患者的治疗效果具有积极和重要的意义。然而，由于该病在临床表现的多样性，容易出现误诊漏诊，错过最佳治疗时间，对病人造成不同程度的不可逆损害。ATP7B(ATPase Cu2+transporting beta polypeptide，β多肽铜转运ATP酶)是肝豆状核变性致病基因，定位于13q14.3，全长78826bp，包括21个外显子和20个内含子，它编码一个P型铜转运ATP酶。ATP7B基因包括14个功能域：6个铜离子结合区、4个跨膜功能区、1个转导区、1个离子通道及磷酸化区、1个核酸结合域和1个三磷酸腺苷(ATP)结合区。目前，已知ATP7B基因突变超过500种，突变类型包括缺失突变、插入突变、移码突变、错义突变和剪接突变等，其中点突变，尤其是错义突变最为常见。突变分为杂合突变和纯合突变两种突变形式，其中杂合突变更为常见。绝大多数突变位点均位于外显子上，多位于跨膜
区及ATP功能区，也有少数突变点位于外显子/内含子交界侧翼区中。因此对ATP7B外显子以外的其他区域进行测序分析，对于明确诊断具有重要的意义。近年来快速发展的高通量二代测序技术(next-generation sequencing,NGS)是在基于第一代测序技术的基础上被广泛应用于遗传病的诊断与携带者筛查。二代测序由模板制备和序列检测过程以及数据分析过程两部分组成。其中，在技术上以边合成边测序为核心，通过大规模平行测序的手段，同时对数以百万计的短DNA片段测序，获得海量的序列信息，然后利用生物信息学工具进行分析。Nature Methods杂志在2014年点评了过去十年对生物学研究影响最深的十大技术，二代测序居首位。二代测序的策略包括全基因组、外显子组、目标区域、表达谱、甲基化、染色体免疫共沉淀测序等。其中，目标区域重测序是指针对感兴趣的目标区域或基因，通过靶区域捕获或扩增的方法富集，然后进行大规模测序。与全基因组、全外显子组测序方法相比，目标区域重测序能大规模、低成本筛查特定疾病的已知致病位点，在临床诊断方面有着巨大的应用前景。
技术实现思路
本申请主要解决的技术问题是提供一种ATP7B基因突变检测引物组、试剂盒、其检测方法及应用，能够准确、灵敏地检测ATP7B基因突变。为解决上述技术问题，本专利技术实施例采用的第一个技术方案是：提供一种用于检测ATP7B基因突变的引物组，与现有技术相比，其不同之处在于，该引物组包括用于在PCR中扩增ATP7B基因多个长片段的检测引物对，该引物组包括选自下列引物对中的至少5对、至少6对、至少7对、至少8对、至少9对、或全部10对引物：序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物对；序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的引物对；序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的引物对；序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的引物对；序列如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示的引物对；序列如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的引物对；序列如SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示的引物对；序列如SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的引物对；序列如SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18所示的引物对；序列如SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所示的引物对。其中，所述PCR的反应条件为94℃预变性1min；每个循环98℃变性10s，65℃退火30s，68℃延伸10min，共30个循环；最后68℃孵育30min。为解决上述技术问题，本专利技术实施例采用的第二个技术方案是：提供一种用于检测ATP7B基因突变的试剂盒，与现有技术相比，其不同之处在于，该试剂盒包括上述的引物组。其中，该试剂盒还包括以下一种或多种试剂:用于从样品提取基因组DNA的试剂；利用所述引物组中的引物对进行PCR反应的试剂；用于处理PCR扩增产物以使扩增产物能够进行高通量测序的试剂；以及用于对处理后的PCR扩增产物进行高通量测序的试剂。其中，所述高通量测序为Ion Torrent测序。为解决上述技术问题，本专利技术实施例采用的第三个技术方案是：提供一种ATP7B基因突变的检测方法，与现有技术相比，其不同之处在于，该方法包括如下步骤：获得样品的基因组DNA；利用上述的任一种引物组或上述的任一种试剂盒的每对引物对分别对所得基因组DNA进行PCR扩增；将每对引物对所得PCR扩增产物混合，对混合后的PCR扩增产物进
行基因型分析以确定基因突变情况。或者，一种ATP7B基因突变的检测方法，与现有技术相比，其不同之处在于，该方法包括如下步骤：获得样品的基因组DNA；利用上述的任一种引物组或上述的任一种试剂盒的每对引物对分别对所得基因组DNA进行PCR扩增；将每对引物对所得PCR扩增产物混合，对混合后的PCR扩增产物进行高通量测序；对高通量测序结果进行分析，确定ATP7B基因突变情况。其中，所述PCR的反应条件为94℃预变性1min；每个循环98℃变性10s，65℃退火30s，68℃延伸10min，共30个循环；最后68℃孵育30min。为解决上述技术问题，本专利技术实施例采用的第四个技术方案是：提供一种利用上述的任一种引物组或上述的任一种试剂盒在ATP7B基因突变检测中的应用。为解决上述技术问题，本专利技术实施例采用的第五个技术方案是：提供一种利用上述的任一种引物组或上述的任一种试剂盒在肝豆状核变性筛查中的应用。本专利技术的有益效果在于：本专利技术的引物组涉及到ATP7B基因的大部分区域，包括外显子和内含子，能较为全面获取患者的ATP7B基因的核苷酸序列情况，明确突变位点；且该引物组针对长片段扩增，在合适条件下扩增出的条带单一，无非特异性条带，且由于扩增片段长，与短片段扩增方法相比测序结果更为均匀，数据分析更为简单；本专利技术的试剂盒及检测方法采用长片段DNA扩增方法结合二代测序技术的方式，具有高效、特异性强、灵敏度高、低成本的优势。附图说明为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本专利技术实施例1中家系成员ATP7B基因上家系谱图。具体实施例为了使本申请的目的、本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测ATP7B基因突变的引物组，其特征在于，该引物组包括用于在PCR中扩增ATP7B基因多个长片段的检测引物对，该引物组包括选自下列引物对中的至少5对、至少6对、至少7对、至少8对、至少9对、或全部10对引物：序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物对；序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的引物对；序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的引物对；序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的引物对；序列如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示的引物对；序列如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的引物对；序列如SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示的引物对；序列如SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的引物对；序列如SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18所示的引物对；序列如SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所示的引物对。
【技术特征摘要】
1.一种用于检测ATP7B基因突变的引物组，其特征在于，该引物组包括用于在PCR中扩增ATP7B基因多个长片段的检测引物对，该引物组包括选自下列引物对中的至少5对、至少6对、至少7对、至少8对、至少9对、或全部10对引物：序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物对；序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的引物对；序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的引物对；序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的引物对；序列如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示的引物对；序列如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的引物对；序列如SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示的引物对；序列如SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的引物对；序列如SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18所示的引物对；序列如SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所示的引物对。2.根据权利要求1所述的用于检测ATP7B基因突变的引物组，其特征在于，所述PCR的反应条件为94℃预变性1min；每个循环98℃变性10s，65℃退火30s，68℃延伸10min，共30个循环；最后68℃孵育30min。3.一种用于检测ATP7B基因突变的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括权利要求1或2的引物组。4.根据权利要求3所述的用于检测ATP7B基因突变的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括以下一种或多种试剂:用于从样品提...
【专利技术属性】
技术研发人员：洪文旭，段永恒，郑开封，林圣，曾序春，段山，
申请(专利权)人：深圳市人口和计划生育科学研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44
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