一种体内活性氧水平失调动物模型的试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种体内活性氧水平失调动物模型的试剂盒，属于生物技术领域。本发明专利技术建立的以秀丽隐杆线虫为体内活性氧水平失调动物模型的试剂盒，该试剂盒中的秀丽隐杆线虫可以模拟动物体内总活性氧含量降低的状态，可用于研究体内活性氧水平失调对机体各种生理生化代谢过程的影响，可在筛选治疗体内活性氧水平失调疾病药物中的应用，为研究相关体内活性氧水平失调疾病的科研工作者提供了一种工具。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种体内活性氧水平失调动物模型的试剂盒，属于生物

技术介绍
已发现越来越多的的疾病与所谓的体内活性氧水平失调有关，但目前体内活性氧水平相关的动物模型多为小鼠，导致研究周期长、费用高，而且无法实现高通量。大家急需一种简便、低费用，且可实现高通量的体内活性氧水平失调动物模型试剂盒。新模式生物秀丽隐杆线虫的isp-1基因编码线粒体呼吸链复合体III的Rieske铁硫蛋白(Rieske iron sulphur protein,ISP)催化亚基，该复合体主要催化电子由泛醌传递到细胞色素c(cytochrome c,cytc)，该基因部分功能缺失会引起电子传递减弱，体内活性氧水平下降，个体的寿命延长。该亚基的序列在所有线粒体及好氧细菌中高度保守。研究表明，isp-1基因RNAi后的秀丽隐杆线虫表现低耗氧，长寿，发育缓慢等特征。因此如果能建立以isp-1基因RNAi后的秀丽隐杆线虫为模型的试剂盒，则可建成一种简便、低费用，且可实现高通量的体内活性氧水平下降的动物模型试剂盒，这将极大方便科研人员研究相关体内活性氧水平失调疾病。本专利技术利用秀丽隐杆线虫作为模式生物，构建isp-1基因RNAi后的秀丽隐杆线虫体内活性氧水平失调动物模型的试剂盒。本专利技术建立的以秀丽隐杆线虫为体内活性氧水平失调动物模型的试剂盒，该试剂盒中的秀丽隐杆线虫可以模拟动物体内总活性氧含量降低的状态，可用于研究体内活性氧水平失调对机
体各种生理生化代谢过程的影响，为研究相关体内活性氧水平失调疾病的科研工作者提供了一种工具。
技术实现思路
本专利技术主要提供一种体内活性氧水平失调动物模型的试剂盒，该试剂盒使用方法简单易行、成本低廉，本专利技术建立的以秀丽隐杆线虫为体内活性氧水平失调动物模型的试剂盒，该试剂盒中的秀丽隐杆线虫可以模拟动物体内活性氧含量降低的状态，可用于研究体内活性氧水平失调对机体各种生理生化代谢过程的影响，为研究相关体内活性氧水平失调疾病的科研工作者提供了一种工具。本专利技术的另外一个目的是提供上述体内活性氧水平失调动物模型试剂盒的使用方法，本专利技术利用isp-1基因RNAi后的秀丽隐杆线虫作为动物模型，操作简单、快速。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种体内活性氧水平失调动物模型的试剂盒，所述试剂盒包括的材料为：①isp-1基因RNAi后的秀丽隐杆线虫；②NGM培养基；③大肠杆菌OP50。所述的isp-1基因RNAi后的秀丽隐杆线虫是通过分子生物学手段将秀丽隐杆线虫isp-1基因片段插入到质粒载体上，并将其转化到宿主细胞中，构建克隆菌，诱导转化后的克隆菌表达isp-1的dsRNA，给秀丽隐杆线虫饲喂克隆菌，即建立isp-1基因RNAi后的秀丽隐杆线虫。其中，所述isp-1基因片段是用PCR的方法从秀丽隐杆线虫基因组DNA中扩增出来的。其中，所述质粒载体为质粒L4440(pPD129.36)，宿主细胞为大肠杆菌
HT115(DE3)。其中，构建重组质粒的方法为：将isp-1基因片段插入到质粒L4440(pPD129.36)两个反向T7启动子之间的多克隆位点处构建重组质粒。其中，所述的诱导转化后的重组克隆菌时所用的诱导剂为异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)。本专利技术还提供一种体内活性氧水平失调动物模型试剂盒在筛选治疗体内活性氧水平失调疾病药物中的应用，所述活性氧水平失调是由活性氧下降引起的。本专利技术还提供一种体内活性氧水平失调动物模型试剂盒在筛选治疗体内代谢异常药物中的应用，所述代谢异常是活性氧下降所引起的。本专利技术还提供一种体内活性氧水平失调动物模型试剂盒在研究体内活性氧升高对机体各种生理生化代谢过程的影响中的应用。另外，本专利技术还提供上述体内活性氧水平失调动物模型试剂盒的使用方法，将isp-1基因RNAi后的秀丽隐杆线虫用镍铬丝挑针分别转移到含有待测化合物的NGM培养基平板和不含有待测化合物的NGM培养基平板上，不含有待测化合物的NGM培养基平板作为空白对照组，每块平板上接种25条isp-1基因RNAi后的秀丽隐杆线虫，待测化合物组与空白对照组均设置3个平行，上述平板均接种大肠杆菌OP50作为秀丽隐杆线虫食物，每天计数待测化合物组与空白对照组的秀丽隐杆线虫的存活条数，直至平板上所有的秀丽隐杆线虫全部死亡，计算待测化合物组与空白对照组中秀丽隐杆线虫的寿命。同以前的方法相比，本专利技术存在以下优势：本专利技术利用秀丽隐杆线虫作为模式生物，构建isp-1基因RNAi后的秀丽隐杆线虫体内活性氧水平失调动物模型试剂盒，该药物试剂盒具有操作简单、
快速、高效的优点，为研究相关体内活性氧水平失调疾病的科研工作者提供了一种工具。附图说明图1为质粒L4440的图谱。图2为秀丽隐杆线虫isp-1基因RNAi后对应基因mRNA表达量的变化。图3秀丽隐杆线虫isp-1基因RNAi后体内活性氧含量的变化。图4为PQ对isp-1基因RNAi后秀丽隐杆线虫寿命的影响。图5为NAC对isp-1基因RNAi后秀丽隐杆线虫寿命的影响。图6为PQ对isp-1基因RNAi后秀丽隐杆线虫运动能力的影响。图7为NAC对isp-1基因RNAi后秀丽隐杆线虫运动能力的影响。图8为PQ对isp-1基因RNAi后秀丽隐杆线虫抗热胁迫能力的影响。图9为NAC对isp-1基因RNAi后秀丽隐杆线虫抗热胁迫能力的影响。具体实施方式以下提供具体实施例以实现本专利技术所述的一种体内活性氧水平失调动物模型的试剂盒，但不限于这些实施例。1.生物材料(1)秀丽隐杆线虫株系：秀丽隐杆线虫野生型N2，购自Caenorhabditis Genetics Center(CGC)。(2)大肠杆菌：E.coli HT115(DE3)，作为重组质粒的宿主细胞，Caenorhabditis Genetics Center(CGC)；E.coli OP50，作为秀丽隐杆秀丽隐杆线虫正常的食物，购自Caenorhabditis Genetics Center(CGC)。(3)质粒载体：L4440(pPD129.36)，RNAi质粒载体，购于Addgene。2.试剂(1)50×TAE Buffer：242g Tris碱，57mL乙酸，100mL 0.5mol/L的EDTA(pH 8.0)，用蒸馏水定容至1000mL，使用时根据要求用蒸馏水进行稀释。(2)1％琼脂糖粉：将1g琼脂糖粉溶于100mL 1×TAE Buffer中，用微波炉加热，使琼脂糖粉完全溶解，室温冷却至60℃左右时加入适量溴化乙锭(EB)，充分混匀后倒入胶槽，插入合适的梳子，待凝胶完全凝固后拔去梳子即可使用。(3)盐酸四环素(Tetracycline Hydrochloride，Tet)：水溶，过滤除菌，母液浓度为25mg/mL，-20℃避光保存(生工生物工程(上海)股份有限公司)。(4)氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)：水溶，过滤除菌，母液浓度为100mg/mL，-20℃避光保存(生工生物工程(上海)股份有限公司)。(5)CaCl2：水溶，高温高压(121℃，20min)灭菌，储存浓度为1mol/L，4℃保存。(6)限制性内切酶：BglII、XhoI、HindIII(购自TaKaRa公司)(7)T4连接酶(购自TaKa本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种体内活性氧水平失调动物模型的试剂盒，所述试剂盒包括的材料为：①isp‑1基因RNAi后的秀丽隐杆线虫；②NGM培养基；③大肠杆菌OP50。

【技术特征摘要】
1.一种体内活性氧水平失调动物模型的试剂盒，所述试剂盒包括的材料为：①isp-1基因RNAi后的秀丽隐杆线虫；②NGM培养基；③大肠杆菌OP50。2.根据权利要求1所述的一种体内活性氧水平失调动物模型的试剂盒，其特征在于，所述的isp-1基因RNAi后的秀丽隐杆线虫是通过分子生物学手段将秀丽隐杆线虫isp-1基因片段插入到质粒载体上，并将其转化到宿主细胞中，构建克隆菌，诱导转化后的克隆菌表达isp-1的dsRNA，给秀丽隐杆线虫饲喂克隆菌，即建立isp-1基因RNAi后的秀丽隐杆线虫。3.根据权利要求2所述的一种体内活性氧水平失调动物模型的试剂盒，其特征在于，所述isp-1基因片段是用PCR的方法从秀丽隐杆线虫基因组DNA中扩增出来的。4.根据权利要求2所述的一种体内活性氧水平失调动物模型的试剂盒，其特征在于，质粒载体为质粒L4440，宿主细胞为大肠杆菌HT115(DE3)。5.根据权利要求4所述的一种体内活性氧水平失调动物模型的试剂盒，其特征在于，将isp-1基因片段插入到质粒L4440两个反向T7启动子之间的多克隆位点处构建重组质粒。6.根据权利要求2所述的一种体内活性氧水平失调动物模型的试剂盒，其特征在于，所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：兰州红菌生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：甘肃;62