一种α‑gal表位修饰试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种α‑gal表位修饰试剂盒及其应用，所述试剂盒的组分包括：MES溶液，UDP‑gal溶液，α1,3‑GT酶液，NA溶液，FITC‑Lectin溶液和生理盐水。该试剂盒能够在体外标记α‑gal于肿瘤细胞表面抗原，并将该标记好的肿瘤细胞体外培育外周血单个核细胞或体内注射，通过人体抗原呈递细胞将肿瘤特异性抗原呈递给人体免疫系统，达到增加免疫系统对肿瘤细胞的识别作用，反应简便，效率高，体系确切，检测方便，可以对肿瘤细胞进行标记，制备α‑gal疫苗。所述α‑gal疫苗可用于无法手术的肿瘤患者或者术后治疗，杀死患者体内残留的肿瘤细胞，也可用于肿瘤高危人群或者肿瘤患者家属或者正常人的预防。

An alpha gal epitope modification kit and its application

The invention discloses a alpha gal epitope modification kit and its application, the test kit includes MES solution, UDP solution gal, alpha 1,3 GT enzyme solution, NA solution, FITC solution and saline Lectin. The kit can be labeled in vitro alpha gal on tumor cell surface antigen, and the labeled tumor cells in vitro cultivation of peripheral blood mononuclear cells or in vivo injection through human antigen-presenting cells to tumor specific antigens to the immune system to identify the role of the immune system, increase the reaction on cancer cells the system is simple, high efficiency, accurate, convenient detection, can be used for markers of tumor cells, the preparation of alpha gal vaccine. The alpha gal vaccine can be used for inoperable tumor patients after operation or treatment, kill patients with residual tumor cells in vivo, and can also be used for cancer prevention in high-risk population or family members of patients with malignant tumor or normal people.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及的是生物医疗
，尤其涉及的是一种α-gal表位修饰试剂盒及其应用。
技术介绍
肿瘤免疫治疗的主要目标是刺激免疫系统对肿瘤相关抗原(tumor-associatedantigens，TAAs)做出免疫应答，消灭原发灶及转移灶的肿瘤细胞。由于大多数的TAA没有被人们所认识，而自体肿瘤细胞包容了所有自身肿瘤抗原，因此，自体肿瘤细胞被认为是发展肿瘤疫苗的潜在来源。现阶段，应用免疫反应来杀伤自身肿瘤细胞的一个重要的限制性因素是自身免疫系统缺乏对TAA肽的识别，因而不能将肿瘤细胞有效的呈递给抗原呈递细胞(antigen-presentingcells,APCs)。这是因为自体肿瘤细胞是由机体正常的细胞变化而来，通常缺乏将其自身直接呈递给APC细胞的特殊信号。不能有效的激活人体内的抗原呈递细胞，从而造成体内肿瘤细胞的免疫逃逸。人体内存在大量天然的anti-Gal抗体，该抗体可以与细胞膜表面的α-gal表位特异性的相互结合，并通过anti-Gal抗体上的Fc片段与APC细胞上的Fcγ受体结合来增强APC细胞对肿瘤细胞的识别和呈递作用。同时，这种天然存在的抗体也是补体介导的急性排斥反应和抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用的基础。现有技术则是通过异源融合基因修饰来使肿瘤细胞表达α-gal表位。但过程复杂，效率不高，不可控因素多，且存在异源争议。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种α-gal表位修饰试剂盒，以解决现有技术通过异源融合基因修饰来使肿瘤细胞表达α-gal表位时，过程复杂，效率不高，不可控因素多，且存在异源争议等技术问题。本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术提供了一种α-gal表位修饰试剂盒，所述试剂盒的组分包括：MES(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)溶液，UDP-gal(尿嘧啶二磷酸半乳糖，Uridinediphosphategalactose)溶液，α1,3-GT(α-1，3半乳糖基转移酶)酶液，NA(神经氨酸酶)溶液，FITC-Lectin(荧光素标记抗凝集素抗体)溶液和生理盐水。进一步地，所述MES溶液为包含等摩尔比的MuCl2和MES的混合溶液，MuCl2用于促进反应中的α1,3-GT酶的活性。本专利技术还提供了上述α-gal表位修饰试剂盒在制备抗肿瘤疫苗中的应用。本专利技术的原理是，利用重组α1,3-半乳糖基转移酶在自体肿瘤细胞膜表面合成α-gal表位来制备自体肿瘤疫苗，利用重组α1,3-半乳糖苷转移酶在自体肿瘤细胞(膜)的糖蛋白和(或)糖脂的糖链末端合成α-gal表位，增强自体肿瘤疫苗的免疫原性，继而可能提高疫苗被APC细胞呈递的效率，强化APC细胞对肿瘤抗原的递呈作用，同时激活补体系统，活化机体的细胞免疫和体液免疫，起到对肿瘤细胞的特异性识别和杀伤作用。α-gal表位合成示意N-acetyllactosaminyl-galepitope(LacNAc)α-gal表位(Galα1-3Gal一β1-4GlcNAc—R)是广泛存在于非灵长类哺乳动物和新大陆猴细胞表面的糖蛋白和糖脂的末端结构，而人类和他们的近亲旧大陆猴、猿由于缺少编码α1,3-半乳糖苷转移酶的活性基因，没有该表位的生成。而在它们体内却存在一种能够与α-gal表位特异性结合的天然抗体anti-αGal，约占血清IgG的1％，这是肠道菌群长期刺激产生的结果。通过在肿瘤细胞膜表面构建α-gal表位，在体内anti-αGal就会与其结合形成抗原抗体复合物。α-1,3半乳糖基转移酶是位于高尔基复合体上的一种糖基化酶，其可以催化尿嘧啶二磷酸半乳糖(UDP-Gal)中的半乳糖基以α1,3键的形式转移到糖脂和(或)糖蛋白上的N一乙酞乳糖胺残基(N-Acetyllactosamine,Galβ1-4G1cNac-R)(简称LacNAc)上，在糖链的末端形成α-半乳糖表位(α-gal表位，Galα1-3Galβ1-4G1cNac-R)，同时生成游离的尿嘧啶二磷酸(UDP)。本专利技术还提供了一种α-gal疫苗，所述α-gal疫苗是利用上述α-gal表位修饰试剂盒对肿瘤细胞进行标记制备获得的，具体包括以下步骤：(1)将肿瘤细胞、MES、UDP-gal、α1,3-GT和NA混合于生理盐水中，置于37℃下反应3小时后，离心去除上清，获得反应细胞，孵育期间多次摇匀细胞，防止细胞沉淀；(2)将反应细胞用生理盐水重悬，加入FITC-Lectin进行荧光标记，充分混匀后，置于室温下避光放置30min，然后上流式细胞仪检测；同时，以未反应的细胞为完全阴性，未反应的加FITC-Lectin的细胞为对照阴性；(3)若检测结果正确，则说明步骤(1)反应成功，步骤(1)获得的反应细胞即为α-gal阳性细胞；(4)将α-gal阳性细胞进行灭活处理，制成α-gal疫苗；所述α-gal疫苗若不立即使用，则需放入-80℃保存。进一步地，所述步骤(1)中，肿瘤细胞、MES、UDP-gal、α1,3-GT和NA混合于生理盐水中的终浓度依次为1×104-7×104个/μl，25mmol/L、0.3-3mmol/L、0.02-2μg/μl和≥1unit/mg，所述步骤(2)中，FITC-Lectin加入的终浓度为≥0.002μg/μl。进一步地，所述步骤(4)中，灭活处理的方法为利用液氮反复冻融，使细胞破碎，达到灭活目的。进一步地，所述步骤(4)中，灭活处理的方法为利用放射性照射进行灭活，比如，用100-2000Gy的γ射线或x射线照射灭活，或用40-500J/m2的紫外线照射灭活等，但不限于此。进一步地，所述步骤(4)中，灭活处理的方法为药物处理，比如，加入40-500ug/ml丝裂霉素或顺铂处理1-24h，获得灭活的细胞等，但不限于此。本专利技术相比现有技术具有以下优点：本专利技术提供了一种α-gal表位修饰试剂盒及其应用，该试剂盒能够在体外标记α-gal于肿瘤细胞表面抗原，并将该标记好的肿瘤细胞体外培育外周血单个核细胞或体内(皮下、皮内)注射，通过人体抗原呈递细胞将肿瘤特异性抗原呈递给人体免疫系统(体液免疫或细胞免疫)，来达到增加免疫系统对肿瘤细胞的识别作用，反应简便，效率高，体系确切，检测方便，可以对自体的肿瘤组织分离的肿瘤细胞进行标记，也可以对培养的肿瘤细胞系进行标记，制备获得α-gal疫苗，来源广泛。所述α-gal疫苗可用于无法手术或者术后肿瘤患者的治疗，杀死人体残留的肿瘤细胞，防止复发，也可用于肿瘤高危人群或者肿瘤患者家属或者正常人的预防。附图说明图1为流式细胞仪检测结果峰图；图2为完全阴性细胞检测结果；图3为对照阴性细胞检测结果；图4为反应细胞检测结果。具体实施方式下面对本专利技术的实施例作详细说明，本实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。实施例11、材料本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。2、方法2.1试剂盒组成需要指出的是，本试剂盒中将各组分制成母液，是为了方便使用，使用时，可根据要求对各组分进行合理的稀释或控制加入量，以控制其在反应液中的终浓度，因此，本专利技术中各组分的浓度不限于本本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种α‑gal表位修饰试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的组分包括：MES溶液，UDP‑gal溶液，α1,3‑GT酶液，NA溶液，FITC‑Lectin溶液和生理盐水。

【技术特征摘要】
1.一种α-gal表位修饰试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的组分包括：MES溶液，UDP-gal溶液，α1,3-GT酶液，NA溶液，FITC-Lectin溶液和生理盐水。2.根据权利要求1所述的一种α-gal表位修饰试剂盒，其特征在于，所述MES溶液为包含等摩尔比的MuCl2和MES的混合溶液。3.一种如权利要求1-2的α-gal表位修饰试剂盒在制备抗肿瘤疫苗中的应用。4.一种α-gal疫苗，其特征在于，所述α-gal疫苗是利用如权利要求1-2的α-gal表位修饰试剂盒对肿瘤细胞进行标记制备获得的。5.根据权利要求4所述的一种α-gal疫苗，其特征在于，所述α-gal疫苗的制备方法包括以下步骤：(1)将肿瘤细胞、MES、UDP-gal、α1,3-GT和NA混合于生理盐水中，置于37℃下孵育反应3小时，然后离心去除上清，获得反应细胞，孵育期间多次摇匀细胞，防止细胞沉淀；(2)将反应细胞用生理盐水重悬，加入FITC-Lectin进行荧光标记，充分混匀后，置于室温下避光放置30min，然后上流式细胞仪检测；同时，以未反应的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王苏鸣，焦苗，王驹，
申请(专利权)人：上海鸣大生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31